大鼠脊髓再灌注损伤中三甲氧苄嗪的保护作用
【关键词】 再灌注损伤
摘要：目的 评价三甲氧苄嗪对大鼠脊髓再灌注损伤的保护作用，并探讨其作用机制。方法 45只SD大鼠随机分为3组，假手术组、对照组和三甲氧苄嗪组，每组15只。建立大鼠脊髓缺血损伤模型，假手术组不阻断主动脉，对照组在肾动脉以下及髂动脉以上同时阻断主动脉20min，三甲氧苄嗪（TMZ）组于主动脉阻断前10min静脉内注射三甲氧苄嗪（3mg/kg）,余同对照组，20min后开放主动脉。分别于阻断主动脉前、松开主动脉前和松开主动脉后2h取静脉血测定丙二醛（MDA）含量。术后48h按Tarlov评分标准评价动物后肢神经功能，然后处死动物，取脊髓进行含水量、MDA含量测定及组织病检查。结果 TMZ组血中MDA含量明显低于对照组（P＜0.05）；TMZ组动物后肢神经功能评分明显高于对照组（P＜0.01）；TMZ组脊髓含水量、MDA含量明显低于对照组（P＜0.01）；TMZ组光镜下脊髓病理改变轻微，而对照组较重，两组病理评分有显著性差异（P＜0.01）。结论 三甲氧苄嗪对大鼠脊髓缺血再灌注损伤具有明显的保护作用。
关键词：三甲氧苄嗪；脊髓；再灌注损伤
The Protective Effect of Trimetazidine on Reperfusion Injury of Spinal Cord in Rats
Abstract: OBJECTIVE To evaluate the effect of trimetazidine on reperfusion injury of spinal cord in rats and discuss its mechanism .METHODS With rat spinal cord ischemia model , we induced ischemia by clamping the aorta just distal to the renal artery and above the iliac bifurcation for 20 min . Forty-five spraque-dawley rats were randomly assigned to three groups(n=15 in each group ) . Sham-operation group subjected to operation dissections without aortic occlusion ; control group undergoing occlusion but receiving no treatment ; TMZ （trimetazidine）group receiving 3mg/kg trimetazidine intravenously in ten minutes before the occlusion of aorta. The malondialdehyde(MDA) content in blood was measured before the occlusion, during the ischemia and after 2 hours of reperfusion respectively. Neurologic status was assessed in 48h after operation , then all animal were sacrificed and the water content , MDA content of spinal cord were also measured . The spinal cord was processed for histopathologic examination . RESULTS Compared with the control group , the TMZ group had lower water content and MDA content (P<0.01) . The neurological scoring of TMZ group was significantly higher than that of control group (P<0.01) . The histopathologic change of spinal cord in TMZ group was milder compared with that in control group (P<0.01) . CONCLUSION Trimetazidine could protect the rat spinal cord from ischemic-reperfusion injury .
Key words：trimetazidine; spinal cord; reperfusion injury
脊髓缺血性损伤是胸腹主动脉手术迄今无法完全避免的严重并发症，其截瘫发生率为0.4%~18%，甚至高达40%［1］。因此提高脊髓保护效果，减少神经系统的并发症是外科医师面临的一大课题。本实验通过大鼠脊髓缺血模型，研究三甲氧苄嗪一种细胞保护因子对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的保护作用，为临床外科应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
健康SD大鼠45只，由北京阜外心血管病研究所实验动物中心提供，雌雄不限，体重300~350g，随机分为3组，假手术组、对照组和三甲氧苄嗪组，每组各15只。
1.2 药品及试剂
三甲氧苄嗪原液购自法国Servier公司。
1.3 实验步骤
大鼠首先给术前药，肌注氯胺酮（25mg/kg）和甲苯噻嗪（5mg/kg），然后股静脉注射硫喷妥钠（20mg/kg）麻醉，气管插管，用小动物呼吸机控制呼吸，潮气量3ml,每分钟60次，吸呼比1∶2。切开皮肤前静脉注射先锋霉素，直肠内置温度探头，尾动脉插管，测量远端动脉血压和心跳，确保动脉完全阻断。行正中剖腹，游离显露肾动脉以下，髂动脉以上的腹主动脉。假手术组：行剖腹手术，但不阻断主动脉；对照组：剖腹后，在肾动脉以下及髂动脉以上同时阻断主动脉20min；三甲氧苄嗪组；主动脉阻断前10min，股静脉内注射三甲氧苄嗪（3mg/kg）,余同对照组。所有动物20min后开放主动脉，丝线关腹，撤离呼吸机，回笼饲养。在整个操作期间动物用电热毯保暖，温度维持在36.5℃~37.5℃，动脉血压和心跳持续监测，静脉内注射肝素500U。48h后，以致死剂量的戊巴比妥（20mg/kg）处死。
1.4 观察及检测指标
1.4.1血中MDA含量
分别于阻断主动脉前和松开主动脉前动物股静脉采血0.5ml，以硫代巴比妥酸法测定血浆MDA含量。松开主动脉后2h重新麻醉动物，取股静脉血0.5ml，进行同样测定。
1.4.2神经系统评分
于术后48h由有经验的不参与实验的人员按照Tarlov［2］评分标准评价后肢神经功能。0级：完全瘫痪；1级：轻微的功能活动；2级：下肢运动良好，但不能站立；3级：能站立，但不能正常行走；4级：可行走，但不灵活；5级：完全恢复。
1.4.3脊髓含水量、MDA含量测定和组织学检查：术后48h处死动物，立即取腰4~6段脊髓，去除软脊膜及神经根，取 20mg脊髓组织，以硫代巴比妥酸法测定脊髓MDA含量。其余脊髓组织取1/2作脊髓含水量检查，脊髓含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。另1/2脊髓固定于福尔马林缓冲液中7天，无水酒精脱水后石蜡包埋，横断面切成4μm薄片，HE染色，光镜观察神经元病变及神经纤维网空泡等情况并按Naslund［3］的分级标准进行病理评分。Ⅰ级：正常脊髓或神经元有少量胞浆内颗粒变性和空泡变性；Ⅱ级：中等程度核浓染神经元与正常神经细胞相间；Ⅲ级：大量的神经元细胞坏死。
1.5 统计学处理
采用SPSS12.0处理软件，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，病理评分及动物后肢神经功能评分采用秩和检验，P<0.05认为差别有显著性。
2 结果
2.1 血中MDA含量
对照组松开主动脉前的血中MDA含量较阻断前及假手术组明显增高（P＜0.01），松开后2h，虽有所下降，但仍明显高于阻断前和假手术组（P<0.05，P<0.01）；三甲氧苄嗪组松开主动脉前的血中MDA含量较阻断前明显增高（P<0.05），但明显低于对照组（P<0.05），松开后2h，基本恢复至阻断前水平，明显低于对照组（P<0.05），详见表1。表1 三组大鼠血中MDA含量比较（略）注：：△与假手术组术相比P<0.01, *与阻断主动脉前相比P<0.01, #与阻断主动脉前相比P<0.05 ，△△与对照组相比P<0.05
2.2 神经系统评分
术后48h神经功能评分0级、1级的动物在对照组的比例为73.3%,而在三甲氧苄嗪组仅为18.2%,评分4级、5级的动物在对照组为零，而在三甲氧苄嗪组达40%，两组相比有显著性差异（P＜0.01），评分详见表2。表2 三组大鼠后肢神经功能评分比较（略）
2.3 脊髓含水量、MDA含量
术后48h三甲氧苄嗪组的脊髓含水量、MDA含量明显低于对照组（P＜0.01），虽高于假手术组，但无统计学意义（P＞0.05），详见表3。表3 三组大鼠脊髓含水量、MDA含量比较（略）注：△与假手术组相比P<0.01△△ 与对照组相比P<0.01
2.4 组织学检查
假手术组脊髓光镜下组织结构完整，无破坏；对照组可见大量神经元皱缩、核溶解、髓鞘肿胀；而三甲氧苄嗪组病理改变轻微，仅见神经元胞浆颗粒变性或空泡变性，与对照组相比，两组病理评分有显著性差异（P<0.01），详见表4，图1~3。表4 三组大鼠脊髓病分级比较
3 讨论
随着麻醉和外科技术的，胸腹主动脉瘤的外科已广泛开展，但术后神经系统并发症如截瘫、轻瘫的发生率依然很高。Svensson［4］将其归纳为三大原因：（1）脊髓缺血的时间和程度（2）无法有效恢复脊髓血供（3）生化介导的脊髓再灌注损伤。同时大量的研究也证实主动脉手术并发脊髓损伤的主要原因为主动脉阻断时的脊髓缺血及开放后的脊髓再灌注损伤。主动脉阻断后，脊髓灌注压降低，导致脊髓缺血缺氧，引起神经元和神经胶质水肿以及脊髓间质水肿，使脊髓内压升高，造成急性脊髓缺血性损害。主动脉开放后，由于氧自由基等物质的大量释放，可引起脊髓缺血后再灌注损伤。脊髓神经细胞膜中脂质含量特别丰富，更易遭受氧自由基的攻击，引起脂质过氧化反应，破坏膜的完整性和通透性，加重脊髓水肿及神经损伤，引起功能障碍。
三甲氧苄嗪作为一种细胞保护因子，首先在1964年引入临床治疗心绞痛，它是一种严格意义上的细胞保护剂，在细胞水平发挥抗缺血的作用，能够增加ATP合成和对抗氧自由基损伤。多项研究已证实它能够对抗缺血和减轻再灌注损伤，对于心脏、肺脏、肾脏、肝脏和肠等器官的缺血有明显的保护作用［5-8］，但对脊髓缺血的保护作用尚未见报道。通过本实验我们从大鼠血中MDA含量及脊髓组织病理学两方面证实了三甲氧苄嗪对缺血脊髓的保护作用。我们发现对照组血中MDA含量在主动脉阻断后明显升高，主动脉开放后虽有所下降，但仍明显高于阻断前，而三甲氧苄嗪组指标在主动脉阻断后虽有增高，但明显低于对照组（P＜0.05），主动脉开放后2h基本恢复至阻断前水平，这表明三甲氧苄嗪能够明显减少血中MDA含量，直接反映它对全身过氧化反应的抑制作用。本实验还观察了脂质过氧化反应对脊髓的损伤，对照组脊髓含水量及MDA含量明显高于假手术组，对照组动物神经功能障碍明显，镜下神经元细胞坏死严重，而三甲氧苄嗪组的脊髓含水量及MDA含量明显低于对照组，动物神经功能的恢复以及脊髓光镜下改变亦明显优于对照组，充分证明了三甲氧苄嗪通过抑制自由基的脂质过氧化反应，达到了对脊髓缺血和再灌注损伤的保护作用。其作用机制可能与以下两点有关：（1）三甲氧苄嗪引导脂肪酸合成磷脂，参与细胞膜的构建，从而减少缺血时游离脂肪酸因为与葡萄糖的竞争性氧化所致的高氧耗和酸中毒，即从改善膜损伤的外环境和促进细胞膜自身的构建双重途径保护脊髓。（2）三甲氧苄嗪可抑制自由基的产生并减少MDA的生成，达到保护脊髓的目的。
总之，本实验证实了三甲氧苄嗪对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的保护作用并阐明了其可能的作用机制，为临床降低胸腹主动脉瘤术后截瘫的发生率提供了新的方法和理论依据。
：
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