依达拉奉对离体兔肺脏保存效果的实验研究

                   作者：周庆玲，孙强，徐长宪，孙金辉，孟国伟

【摘要】  目的探讨依达拉奉对离体兔肺脏保存质量的影响。方法健康大白兔12只，按照随机原则，分为LPD组（n=6）和E组（n=6）。LPD组用低钾右旋糖酐（LPD）液行肺灌洗及肺保存，E组用含依达拉奉20 mg/L的LPD液行肺灌洗及肺保存。实验结束时取肺静脉血标本作血气分析及制备血清测定丙二醛(MDA)含量与超氧化物歧化酶（SOD）活性；取肺组织标本测干／湿重及送病理。结果两组肺静脉血PaO2、PaCO2、 血浆丙二醛(MDA)含量及SOD活性、肺组织干／湿重比（D/W）均无显著差异(P>0.05)。肺组织病理结果显示两组均有肺组织毛细血管轻度充血，肺泡结构尚可，肺泡间质少量粒细胞浸润，肺泡腔内轻度渗出及少量红细胞。结论在离体冷保存6 h再灌注的兔肺模型，依达拉奉未显示出明显优于低钾右旋糖酐液(LPD)的保护效果。

【关键词】  低钾右旋糖酐液；依达拉奉；肺保存

　　The Effect of Edaravone on Isolated Rabbit Lung Preservation

　　Abstract: OBJECTIVETo investigate the pulmonary preservation effect of Edaravone on isolated rabbit lung. METHODS12 rabbits were randomly divided into 2 groups: LPD group(n=6), lungs flushed and preserved with LPD solution;  Edaravone group(n=6): lungs flushed and preserved with LPD solution plus Edaravone 20mg/L. All lungs were reperfused with venous blood for 10 minutes after 6 hours cold preservation. Blood samples were analyzed for PO2 , PCO2 , serum MDA and SOD. Lung tissue  wet-to-dry weight ratio compared, samples of left lung tissue were sent for histologic evaluation. RESULTSPaO2 and PaCO2 levels, serum MDA and SOD, and Lung tissue D/W ratio showed no significant difference between two groups(P>0.05); histologic evaluation showed mild changes in lung tissue in both groups.CONCLUSIONLPD solution plus edaravone and LPD solution showed similar protective effects on isolated rabbit lung preservation.

　　Key words：LPD solution；Edaravone；lung preservation

　　自从Cooper等1983年在加拿大多伦多大学首次成功地为一位肺纤维化晚期患者实施了单肺移植手术［1］，之后的二十余年，肺移植逐渐成为终末期肺部疾患的有效手段。但是，供肺短缺、移植早期的肺缺血再灌注损伤(lung ischemia reperfusion injury)依然是限制肺移植在临床上广泛应用的主要因素。因此，如何延长器官保存时间，改善保存器官移植后功能，减轻移植器官的缺血再灌注损伤是亟需探索的重点之一。
肺缺血再灌注损伤的重要原因之一就是氧自由基形成。依达拉奉是一种自由基清除剂，通过清除自由基，抑制脂质过氧化，对多种脏器及组织的缺血再灌注损伤有保护作用。Ito等的研究发现依达拉奉对大鼠肠缺血导致的肺损伤有保护作用，能减少白细胞浸润，减轻脂质过氧化，抑制肺内致炎性细胞因子IL-6 mRNA 表达［2］。本研究在低钾右旋糖酐液(LPD)液中加入依达拉奉20mg/L，观察其对离体兔肺的保护作用。

　　1材料与方法

　　1.1实验动物

　　健康大白兔12只，雌雄不拘，体重（3000±200）g（购于山东大学医学院实验动物中心）。
 
　　1.2实验设备及试剂

　　盒美国E150型纽邦（NEWPORT）呼吸机；德国产StokertⅡ体外循环机的双泵头；德国产Sartorius analytic分析天平；北京医用离心器厂生产LDZ5-2型低速离心仪；山东潍坊医药器械公司生产立鹤牌电热恒温干燥箱；福建新大陆生物技术有限公司生产722S可见光分光光度计；国产恒温水浴箱；美国雅培公司的i-STAT血气生化分析仪；.丙二醛（MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒以及蛋白定量测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；依达拉奉（必存）注射液系江苏先声药业生产，规格10 mg/5ml,生产批号80-041101。

　　1.3动物模型制备

　　兔经耳缘静脉建立静脉通路，静脉注射氯胺酮2 mg/kg，氯化琥珀胆碱1 mg/kg，麻醉后仰卧位固定于手术台。颈部正中切口，气管切开插管，接E150型纽邦（NEWPORT）呼吸机辅助呼吸，吸氧浓度21%，呼吸频率40～50 次/分，潮气量15 ml/kg。兔去毛消毒，前正中线开胸，剪除纵隔胸膜，切除胸腺暴露气管，打开心包，游离上下腔静脉。肝素3 mg/kg经右心耳进行肝素化，经右室流出道插入16GA肺动脉灌注管并固定。右房插管收集自体静脉血入真空密闭储血袋, 回收血量约(150±20)ml，红细胞压积（Hct）（0.35±0.03），生理盐水稀释至Hct 0.25, 密闭保存，以备再灌注用。待心脏停跳时, 经右室流出道肺动脉插管，用置于60 cm高度、预冷4℃的肺保存液冲洗肺脏 ,同时切开左心耳引流。冲洗期间继续肺通气。灌注总量60 ml/kg，冲洗完毕，完整游离出心肺组织，吸气末结扎气管使肺处于膨胀状态，置于4℃与灌洗液相同的保护液中保存。于4℃环境中保存6 h，再行离体复灌。复灌时参照LS Wang模型［3］，取出心肺组织，气管插管接呼吸机呼吸参数如同前述。固定好肺动脉灌注管，同时用滚压泵（德国StokertⅡ体外循环机的双泵头，泵管采用停跳液灌注装置的泵管，1.4 ml/转，15转/min）将自体血(预温至30℃)以20 ml/min泵入肺动脉，复灌时间10 min。实验结束时，取肺静脉血标本作血气分析及制备血清测定丙二醛(MDA)含量与超氧化物歧化酶（SOD）活性；取肺组织标本测干／湿重及送病理。

　　1.4实验分组及指标测定

　　1.4.1实验分组LPD组（n=6）：肺灌洗及肺保存均采用4℃ LPD液（成分见表１）；E组（n=6）：在LPD液中加入依达拉奉20 mg/L。表1LPD液及含依达拉奉LPD液的主要成分（略） 

　　1.4.2 指标测定

　　1.4.2.1 肺静脉血标本作血气分析

　　1.4.2.2血浆丙二醛(MDA)含量与超氧化物歧化酶（SOD）活性测定血标本离心取血清保存于-20℃ 冰箱中待测。采用硫代巴比妥(TBA)法测定MDA含量，黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定SOD活性。

　　1.4.2.3肺组织干／湿重比（D/W）测定实验结束时取1 g左右左肺组织分析天平称重为湿重，置于70℃电热恒温干燥箱中烤48 h后称重为干重，干重与湿重之比即为肺干湿重量比(D/W)。

　　1.4.2.4肺组织光学显微镜检查取左肺下叶约1cm×1cm×1cm大小组织块，用10%福尔马林固定，予常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察形态学改变。

　　1.5统计学处理结果

　　均以均数±标准差表示，所有统计学处理SPSS 10.0完成，组间比较采用方差分析， P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1肺静脉血气分析结果

　　E组PaO2（63.8±8.5）mm Hg与LPD组PaO2（61.5±7.8）mm Hg，差异无显著性（P>0.05）。E组PaCO2（37.59±2.12）mm Hg与LPD组PaCO2（35.71±1.18）mm Hg，差异无显著性（P>0.05）。

　　2.2血浆丙二醛(MDA)含量E组为(6.03±0.72)nmol/ml， LPD组为(6.17±0.85) nmol/ml，E组血浆MDA含量略低于LPD组，但差异无显著性(P>0.05)。

　　2.3血浆SOD活性E组为(411.27±11.8)U/ml, LPD组为(389.21±10.5)nmol/ml，E组血浆SOD活性较LPD组略高，但无显著差异(P>0.05)。

　　2.4肺组织干／湿重比（D/W）E组为(0.1967±0.002)，LPD组为(0.1958±0.002)，两组无显著差异(P>0.05)。

　　2.5肺组织病理结果两组均见肺组织毛细血管轻度充血，肺泡结构尚可，肺泡间质少量粒细胞浸润，肺泡腔内轻度渗出及少量红细胞。

　　3讨论

　　近三十年来，人们围绕着供肺保存开展了大量实验研究工作，但至今仍未获得满意的结果。提高供肺保存质量，延长供肺保存时间，仍是该领域迫切需要解决的课题。

　　研究证实氧自由基和活性氧在缺血再灌注损伤中起主要作用。缺血再灌注时产生的氧自由基对组织的损伤包括：① 导致脂质过氧化,损伤生物膜（包括细胞膜、溶酶体膜、线粒体膜、核膜等），改变膜的液态性、流动性，导致生物膜通透性增强。含双键脂肪酸过氧化可生成丙二醛，它的产生与脂质过氧化相平行，因而测定丙二醛含量可代表脂质过氧化物的浓度。② 自由基可使蛋白质分子聚合、交联、断裂，使蛋白质变性、酶活性降低；损伤DNA；破坏间质, 使细胞间的透明质酸降解从而使细胞间基质疏松，弹性降低。肺缺血再灌注损伤的病理表现主要有肺组织内ATP含量减少，肺泡表面活性物质生成减少，肺动脉高压，非心源性肺水肿，肺淋巴回流增加（淋巴液中蛋白含量先低后高），肺顺应性降低，低氧血症，肺内分流量增加，导致肺移植或体外循环后的急性肺功能不全，ARDS。肺组织形态学改变有肺间质水肿、出血，大量富含蛋白的液体漏入肺泡腔（有时可见透明膜），肺泡萎陷、肺不张；镜下见肺泡Ⅰ型上皮细胞胞浆肿胀、破裂，Ⅱ型细胞板层体（储存表面活性物质的场所）消失，毛细血管内皮细胞的胞浆、线粒体、内质网和细胞核肿胀，基底膜水肿，气血屏障增厚乃至破坏。

　　目前一致认为供体肺损伤不仅由于缺血所致, 还与肺再灌注损伤有关。肺损伤贯穿了肺缺血,保存及再灌注全过程。因此，对供肺的保护包括：① 尽量避免和减少缺血的发生；②    缺血期间的低温及药物保护；③ 尽量减轻再灌注阶段的损伤。满意的肺保护方法应包括急性肺缺血时的肺灌洗、降温, 使肺对缺血的耐受性增加；保存液应能维持肺在低温下能量代谢需要, 避免细胞损伤的加重；尽量减少再灌注损伤的发生。1988年Belzer FO提出了实质器官保护的五个原则：① 最大限度地减轻低温所致的细胞肿胀；② 防止细胞内酸中毒；③ 防止灌注阶段器官间质水肿；④ 防止自由基损伤（特别是再灌注时）；⑤ 提供再灌注时再生高能磷酸键的成份［4］。低温肺保护液的肺动脉灌注可明显减轻肺的再灌注损伤。国内外在临床上广泛使用的组织保护液是细胞内型的保护液(IFS)如Euro-Collins液、 UW液等, 这些保护液在临床上已成功地进行了肺移植和心肺联合移植。 然而, 许多实验和临床研究均表明IFS会引起肺血管收缩, 使离体肺灌注不良, 加重肺缺血损伤及再灌注损伤。正因为IFS有以上问题, 近年来许多学者采用细胞外液型保护液(EFS)如LPD液对肺保护进行研究,其研究结果表明EFS能延长肺保存时间。Keshavjee等报告采用低钾葡醛糖液(LPD液)可延长肺保存时间至12 h，并认为该液效果优于Euro-Collins液的原因可能是：① 高钾溶液可引起明显肺血管痉挛，导致肺动脉灌洗压升高和灌洗效果较差；② LPD液中的磷酸缓冲系减少缺血期间酸中毒程度；③ LPD液能提供适宜的胶体渗透压，保持血管内水份，减少间质水肿形成［5］。通过实验比较发现LPD液优于EC液。EC液作肺动脉冲洗时，肺血管阻力急聚升高，而LPD液冲洗时没有显著升高， 用EC液保存的器官再灌注后肺的氧合功能差，而用LPD液保存的器官再灌注后的氧合效果要优于EC液。 LPD液亦优于UW液。有人比较LPD液及UW液灌注保存30 h后的兔肺，再灌注后LPD液组的氧合功能显著优于UW液组。总之，越来越多的资料显示，LPD液可能是最有前途的肺保存液。因此，有不少学者在LPD液的基础上进行改进，以提高其保存效果。

　　依达拉奉(Edaravone 3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)是一种自由基清除剂，具有自由基清除和抑制脂质过氧化的作用，对多种脏器及组织的缺血再灌注损伤有保护作用。依达拉奉可以抑制脑细胞(血管内皮细胞和神经细胞)的过氧化作用，延迟神经细胞死亡，减轻脑缺血以及脑缺血引起的脑水肿和组织损伤［6］；可通过预防线粒体过氧化应激和改善肝脏缺血后再灌注时的能量代谢，保护线粒体免受损伤，并预防内毒素引起的肝损伤, 减少细胞凋亡［7］； 可抑制右旋糖酐硫酸钠所致的大鼠结肠炎,保护小肠缺血再灌注损伤，并能抑制损伤后的多发性溃疡和出血，显著降低CINC-1（细胞因子诱导的白细胞趋化因子）蛋白和CINC-1 mRNA水平［8］。实验及临床研究还表明依达拉奉对心脏［9］、肾脏缺血再灌注损伤［10］、肢体缺血再灌注损伤［11］有保护作用。国外已有学者开始对依达拉奉的肺保护作用进行探索。Ito等就依达拉丰对鼠肠缺血而致的肺损伤的保护作用进行了研究，发现依达拉奉能减少白细胞浸润，减轻脂质过氧化，抑制肺内致炎性细胞因子IL-6 mRNA 表达［2］。

　　本研究在LPD液的基础上加入依达拉奉20 mg/L，观察其对离体兔肺保存的效果。结果发现，离体兔肺冷保存6 h，再灌注10 min，虽然再灌注后E组肺静脉血中MDA含量比LPD组略低，而血浆SOD活性较LPD组略高，依达拉奉组与单纯LPD液灌洗保存组在所测定各项指标均未显示有显著差异。这种结果的可能原因为：① 低钾右旋糖酐液(LPD液)对6 h内离体肺的保存效果较好，肺脏再灌注后损伤不明显；② 依达拉奉作为一种自由基清除剂，具有自由基清除和抑制脂质过氧化的作用，但其给于途径、时机、剂量仍需进一步研究；③ 实验样本小；④ 本实验采用的离体兔肺保存再灌注模型再灌注时间短，有些病理改变可能无法探知。

【】
  　　［1］Cooper JD, Pearson FG, Patterson GA, et al. Technique of successful lung transplantation in humans［J］. J Thorac Cardiovasc Surg, 1987, 93: 173-181.

　　［2］Ito K, Ozasa H, Horikawa S. Edaravone protects against lung injury induced by intestinal ischemia/reperfusion in rat［J］.Free Radic Biol Med, 2005,38(3):369-374.

　　［3］Liang-shun Wang,Koechi yoshikawa,Shinichiro Miyoshi, et al.The effect of ischemic time and temperature on lung preservation assessment［J］.J Thorac Cardiovasc Surg,1989,98:333-342.

　　［4］Belzer FO, James HS. Principles of solid-organ preservation by cold storage［J］. Transplantation,1988,45:673-676.

　　［5］Kashavjee SH, Yamazaki F, Cardoso PF, et al. A method for safe twelve hours pulmonary preservation［J］. J Thorac Cardiovasc Surg, 1989, 98:529-534.

　　［6］杨政，吴玉林.急性脑梗死的新型脑保护药依达拉奉［J］.新药杂志,2002,11(12):911-913.

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