不同浓度硫化氢托马斯液心脏保存效果的实验研究
【摘要】 目的探讨含有各种浓度硫化氢（H2S）的HST（H2S St.Thomas Ⅱ solutions）液对大鼠离体心脏的保存作用。方法将32 只SD大鼠随机平均分为4组,分别用托马斯（St.Thomas Ⅱ solutions，STH）液（Ⅰ组）、含4×10－2mmol/L NaHS的HST液（Ⅱ组）、含4×10－1mmol/L NaHS的HST液（Ⅲ组）和含4mmol/L NaHS的HST液（Ⅳ组）对心脏进行保存。采用Langendorff心脏灌注和工作模型装置进行心脏功能测定,比较6 h后心功能恢复率以及能量变化、心肌含水量,观察心肌超微结构改变。结果心脏保存6 h后, Ⅳ组左心室功能损伤严重，Ⅱ、Ⅲ组左心室功能损伤较轻，其中Ⅲ组最轻。Ⅲ组冠状动脉流量(CF)恢复率较Ⅰ、Ⅳ组好；Ⅰ组心肌中ATP、乳酸 (LD)、糖原含量及心肌含水量与其它3组比较,差异有统计学意义；Ⅳ组心脏复跳时间较Ⅰ组为长;心肌超微结构Ⅲ组损伤最轻;Ⅲ组心肌保存良好。结论HST保存液对大鼠心脏的保存在6 h内有明显的保护作用，效果优于STH液；含4×10－1mmol/L NaHS的HST液保存效果较好，而高浓度H2S对心肌有损害作用。
【关键词】 硫化氢；KATP通道；器官保存液；心脏；大鼠
Protective Effects of Different Concentration H2S St.Thomas Ⅱ Solutions
Abstract: OBJECTIVE To evaluate the protective effects of a novel cardiac preservation solution with different concentrations of H2S on isolated rat heart . METHODSThirty－two SD rats were divided randomly into four groups: in GroupⅠrat hearts were preserved in pure STH （St. Thomas Ⅱ） cardioplegia solution , GroupⅡin HST solution containing 4×10－2 mmol/L NaHS, Group Ⅲ in HST solution containing 4×10－1 mmol/L NaHS, Group Ⅳ in HST solution containing 4 mmol/L NaHS and all the hearts were preserved respectively for 6 hours. The isolated hearts were perfused in the Langendorff rat mode for functional evaluation before and after preservation. ATP,LD, glycogen, wet weights in myocardium and cardiac ultrastructure were measured after reperfusion. RESULTSThe impairment of the left ventricle function in Group Ⅳwas serious , while that in Group Ⅲ was mild. The recovery of coronary flow in Group Ⅲ was better than the others. There were significant differences in respects of content of ATP, LD , glycogen and wet weight of myocardium between GroupⅠ and the other Groups. The time,from the reperfusion starting to heart beating, was the longest in Group Ⅳ. The ultrastructure changes were slight in Group Ⅲ . CONCLUSIONCompare to STH solution ,HST solution are more effective for isolated rat heart preservation in 6 hours. The concentration of 4×10－1 mmol/L NaHS has better preservation effect,and high concentration H2S solution is harmful for myocardial preservation.
Key words：H2S；KATP channel；Organ preservation;Heart;Rats
心脏移植作为挽救终末期心脏病患者的唯一有效方法得到了广泛应用，而供心不足及供心保存时限短严重制约了其进一步。加强供心保护，提高供心保存时限和保存质量，对移植手术的成败具有重要意义。上世纪90年代中期，人们发现内源性硫化氢（H2S）是一种KATP通道开放剂（PCOs）［1-2］，而且有实验表明，将小鼠置于不同浓度（0 ～80 μl/L）的外源性H2S气体中，小鼠出现正相关浓度依赖性的中心体温（CBT）和代谢率（MR）的下降，出现“类假死”（suspended animation-like）状态，中心体温、代谢率、氧耗量均大幅度下降［3］。故设想，应用含有不同浓度H2S的HST（H2S St. Thomas Ⅱsolution）液，与托马斯（St. Thomas Ⅱsolutions，STH）液保存效果进行比较，对H2S在心脏保存中的作用进行初步研究。
1资料与方法
1.1STH液组成成分NaCl(120 mmol/L) , KCl(16 mmol/L)，MgCl2(16.6 mmol/L)，CaCl2(1.2 mmol/L)，NaHCO3(10 mmol/L)，pH为7.8，渗透压为295～296 mOsm/L。NaHS由HCl和Na2S临用前配制。
1.2实验分组
选取健康SD大鼠32 只，体重180～220 g ，随机分为4 组，每组8 只，分别用STH液（Ⅰ组）、含4×10－2mmol/L NaHS的HST液（Ⅱ组）、含4×10－1mmol/L NaHS的HST液（Ⅲ组）和含4 mmol/L NaHS的HST液（Ⅳ组）灌停并保存心脏。
1.3实验方法
大鼠称重后,戊巴比妥钠( 65 mg/kg) 腹腔内注射麻醉，尾静脉注射质量浓度为10 g/L的肝素抗凝(0.12 ml/只)。迅速开胸取出心脏，放入0 ℃～4 ℃ Krebs - Heseleit（K－H）缓冲液中并移至Langendorff 灌注装置上,用37 ℃ K－H 液（95% O2 和 5% CO2 混合气体预充30 min）顺行灌注，灌注压维持在90 cmH2O，灌注5 min 后，切开左心耳，经左心房、二尖瓣，将连接有测压导管的心室球囊送入左心室，另一端连接多导生理记录仪。往心室球囊内缓慢注射适量生理盐水( 40～60 μl)，使左心室舒张末压为10 mmHg。平衡15 min 后，心脏搏动可达到稳定状态，测定血流动力学基础值，30 min 后，逐渐降低灌注温度至30 ℃以下，经主动脉根部分别灌注4 ℃的四组心脏保存液（80 ml/kg）使心脏停跳，每只心脏分别在四种心脏保存液中低温浸泡保存6 h。6 h 后复灌，逐渐恢复灌注温度至37 ℃。15 ～20 min 后，心脏搏动可达到稳定状态，每隔5 min 测定1 次血流动力学指标值和冠脉流出量，连续测定4 次。心脏灌注完成后，在左心室上取一块重量>300 mg 的心肌组织，保证每次切取位置尽可能一致，置于液氮罐中保存，以备测定心肌ATP、LD和糖原含量。另取一块心肌组织，称湿重后放入100 ℃的烘箱中烘烤24 h，再次称干重，心肌含水量。
1.4检测指标
① 测定复灌至心脏复跳时间，超过30 min即为复跳未成功；记录心率(HR)、冠脉流量（CF）、左心室收缩峰压(LVSPP)、左心室内压最大上升速率(＋dp/dt max)；各项指标的恢复率按（保存6 h后数值/保存前数值）×100％计算； ②心肌ATP含量取心尖部组织用高效液相色谱分析法测量［4］；③ 乳酸（LD）、糖原含量分别使用酶促法、蒽酮试剂法（南京建成生物工程研究所试剂盒）测定；④心肌含水量按(湿重-干重)/湿重×100 %计算；⑤心脏保存6 h后各组取1 块心肌组织行HE染色光镜观察和透射电镜观察。
1.5数据处理数据均以（±s）表示，应用SPSS 13.0软件进行数据分析，采用单因素方差分析（ANOVA）对多组数据进行均数比较，进一步做组间比较采用Bonferroni检验。P＜ 0. 05有统计学意义。
2结果
2.1心脏复跳时间比较心脏保存6 h后，各组心脏均能复跳成功，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组心脏复跳时间分别为(63.38±9.20) s 、(65.50±8.49) s、 (73.00±8.35)s和 (113.38±17.71)s，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组之间比较，无显著差异(P>0. 05) , Ⅳ组复跳时间明显增长，与其它组比较，差异有统计学意义( P<0. 01)。
2.2心功能指标的变化与其它三组比较，HR恢复率Ⅲ组最高 (P<0. 05)，Ⅳ组最低 ( P< 0. 05)，Ⅰ、Ⅱ组间无差异（P>0. 05）；CF恢复率Ⅲ组最高，与Ⅰ、Ⅱ组相比有显著性差异 (P<0. 05)，比Ⅳ组高但差异无统计学意义(P>0. 05)；LVSPP和＋dp/dt max恢复率Ⅲ组最高，Ⅳ组最低，Ⅲ、Ⅳ组间比较有显著差异 (P<0. 05)，与Ⅰ、Ⅱ组相比无显著性差异(P>0. 05)，Ⅰ、Ⅱ组比较亦无显著差异(P>0. 05)。见表1。表1保存6 h后心功能恢复率比较（略）注：Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组与Ⅰ组比较：* P<0. 05，** P<0. 01；Ⅲ、Ⅳ组与Ⅱ组比较：△P<0. 05，△△P<0. 01；
Ⅲ、Ⅳ组比较：＃P<0. 05，＃＃ P<0. 01
2.3心肌ATP及含水量变化心脏保存6 h后，Ⅰ组心肌ATP含量最低，与其他组比较，有显著差异 (P<0. 01)，其余各组间无显著差异(P>0. 05)；Ⅰ组心肌含水量最高，与其他组比较，有显著差异 (P<0. 05)，Ⅳ组心肌含水量最低，但与Ⅱ、Ⅲ组比较，无显著差异 (P>0. 05)，Ⅱ、Ⅲ组间比较无显著差异(P>0. 05)。见表2。表2ATP、LD、糖原及心肌含水量比较（略）注：Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组与Ⅰ组比较，*P<0. 05，**P<0. 01；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组比较，P>0. 05
2.4心肌LD、糖原变化Ⅰ组心肌LD和糖原含量均最低，与其他组比较，有显著差异 (P<0. 05)，其余3组间无显著差异 (P>0. 05)。见表2。
2.5心肌组织HE染色光镜观察Ⅰ组可见心肌层有较重水肿，表现为依心肌排列方向有宽窄不一的间隙，心肌纤维(细胞)的皱缩程度较重；Ⅱ组可见心内膜下、心肌层、心外膜下均有水肿，表现为依心肌排列方向有宽窄不一的间隙，但程度较Ⅰ组轻；Ⅲ组可见心内膜下、心肌层、心外膜下均无明显水肿，心肌细胞排列有序，细胞核长杆状，胞质(肌丝)丰富。血管腔内皮细胞排列良好；Ⅳ组可见心内膜下、心肌层、心外膜下水肿较轻，心肌纤维(细胞)有一定程度的皱缩、变细。
2.6心肌组织透射电镜观察Ⅰ组可见心肌细胞结构紊乱，肿胀明显，肌节缩短，线粒体扩张，嵴溶解空泡化，部分线粒体出现嵴融合，形成棒状、杆状结构，糖原颗粒明显减少，肌质管明显扩张；见图1。Ⅱ组可见肌节缩短，肌丝排列紊乱，模糊不清，Z线缩短，M线消失，线粒体肿胀，部分线粒体嵴不清晰，肌浆网无明显扩张，糖原颗粒减少；见图2。Ⅲ组可见细胞核，肌小节结构正常，肌丝排列整齐，M线清楚，I线模糊，线粒体轻度水肿，嵴清晰可见，糖原颗粒分布均匀；见图3。Ⅳ组可见细胞收缩明显，肌节缩短，肌纤维Z 带不清晰。部分线粒体肿胀，肌质管扩张；见图4。
3讨论
目前临床应用的心脏保存液，其主要机理为细胞外高钾使跨膜钾浓度梯度和膜电位负值下降，钠内流减慢。当膜电位下降时快钠通道失活，氧自由基产生增多，引发难以克服的心肌缺血/再灌注损伤，是造成术后心功能减退及冠状动脉内皮细胞功能损伤的重要机制。为有效减轻或遏制损伤，加强对PCOs应用于心脏保存液的研究，是十分必要的，亦是此方面探讨的热点。
有研究表明，H2S是目前被确定的第一个PCOs气体开放剂。应用PCOs激活KATP通道，引起心肌细胞动作电位平台期明显缩短，Ca＋2内流减少，防止细胞钙超载，使心肌快速停跳，减少ATP消耗，使ATP在冷冻期间更多地被利用在维持细胞内自身平衡，保护了细胞跨膜离子梯度、胞内的能量储备及细胞的完整性，能有效的防止心肌损伤［5］。
本实验应用HST液保存的心脏，较低浓度时（Ⅱ组、Ⅲ组），其左心功能恢复率包括HR、CF、LVSPP和＋dp/dt max均高于对照组，但效果并未随H2S浓度升高而继续升高。Ⅱ组左心功能恢复率高于Ⅰ组，Ⅲ组左心功能恢复率最高，但Ⅳ组左心功能恢复率反而最低。有实验表明大鼠离体心脏持续灌流NaHS，呈浓度依赖性抑制左心室的收缩和舒张功能，高浓度1 mmol/ L时则明显降低HR、CF、LVSPP和＋dp/dt max［6］。H2S作为PCOs对实现心脏超极化停搏，防止钙超载，减少ATP消耗有积极作用。复灌后将H2S冲掉，防止其对心功能的不良影响。然而，目前对H2S的心脏毒性浓度及毒性效应尚不清楚，但4 mmol/L已达其生理浓度的80倍以上，可能由于其本身的毒性对心肌造成不可逆损害，致使Ⅳ组左心功能恢复较对照组差。另外从复跳时间观察，Ⅳ组复跳时间明显延长，可能与复灌时需较长时间才能清除H2S有关。
有实验表明H2S的供体NaHS腹膜下注射能明显扩张冠脉，提高心肌灌注，改善心肌损伤［6-7］，本实验中用含NaHS的HST液灌注停搏心脏，可以扩张冠脉，使停搏液灌注更充分，心肌快速停搏，减少能量消耗。同时复灌时其扩冠效应可以明显增加冠脉流量。观察证明，Ⅱ组、Ⅲ组CF恢复率明显高于Ⅰ组，较大的CF，能加速氧的供应，尽快偿还缺血保存期欠下的“氧债”，提高心肌收缩力，同时可以迅速带走缺血保存期的代谢废物，缓解酸中毒，促进心脏功能的恢复［8］。Ⅳ组CF恢复率较低考虑为高浓度H2S造成心肌抑制，心功能，特别是HR下降明显抵消其冠脉扩张作用。
有关实验表明将小鼠置于不同浓度（0 ～80 μl/L）的H2S气体中，小鼠出现浓度依赖性的中心体温（CBT）和代谢率（MR）的下降。当环境H2S气体浓度为80 μl/L，并降低环境温度时，小鼠耗氧量、CO2生成量、HR降至正常值的10 %以下，当恢复正常的温度和气体环境后，小鼠CBT和MR很快恢复正常。小鼠出现的“类假死”现象与某些动物生理条件下发生的冬（夏）眠很相似，其机理为H2S作为细胞色素C氧化酶的抑制剂，可抑制组织器官的氧化磷酸化，造成代谢下降［3］。心脏在低温缺血的条件下保存较长时间后，心肌内储存的能量物质(ATP 、CP)分解增加，来维持组织的结构、功能、代谢。高能磷酸盐的含量可作为判定心肌缺血程度的重要指标，长时间缺血后心脏机械功能的恢复与心肌组织ATP的含量也密切相关，因为ATP的合成主要依赖线粒体的功能，线粒体合成及利用ATP的能力高，ATP的水平亦高，故改善线粒体功能，增加心肌内高能磷酸盐的储备、降低缺血心肌对高能磷酸盐的消耗对于缺血心肌的恢复是十分重要的。本研究显示，Ⅱ组、和Ⅳ组复灌后ATP含量均高于Ⅰ组，透射电镜观察也显示Ⅲ组的心肌线粒体排列均匀，结构完整，无肿胀。传统观点认为H2S阻断呼吸链，造成细胞损伤，但在离体低温保存状态下微量H2S可抑制组织器官的氧化磷酸化，造成代谢明显下降，无氧酵解产生的ATP可以维持细胞的消耗，从而保护线粒体功能，防止能量储备耗竭。这对改善缺血后心肌组织能量代谢有积极作用。本实验中Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组复灌后LD、糖原含量均高于Ⅰ组，亦证明了此观点。同时在体内H2S和NaHS形成动态平衡，以此维持H2S在体内的稳定，还可以缓冲内环境pH值水平，防止LD生成过多造成的酸中毒。
综上所述，我们认为H2S不仅具有PCOs的作用，还具有降低代谢，增加心肌能量储备的功能。经HST液保存6 h后，Ⅲ组心功能指标，ATP含量，心肌能量储备和心肌组织超微结构均优于Ⅰ组，既发挥了H2S的有益作用，又避免了高浓度H2S的有害作用，找到了一个平衡点。HST保存液对大鼠心脏的保存在6 h内有明显的保护作用，在心脏功能恢复率、能量保护方面效果优于STH液，含4×10－1mmol/L NaHS的HST液保存效果最好。
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