不同肺保护剂对兔体外循环手术肺保护的比较

                作者：王建明，王明海，陶曙光，韩建刚，杨仕海

【摘要】  目的比较不同的肺保护剂在兔体外循环（Extracorporeal circulation，ECC）中的肺保护作用。方法将15只新西兰纯种大白兔（体重约2 kg）随机分成三组，即沐舒坦（30 mg/kg）组（组Ⅰ，n=5）,抑肽酶（10万KIU/ kg）组（组Ⅱ；n=5）和乌斯他丁（1万U/ kg）组（组Ⅲ,n=5）。在开胸后和ECC停机30 min后取兔肺组织，在光镜、电镜下观察肺组织术前、术后病理变化，并比较三组间的不同；同时将肺组织制成匀浆、并于ECC前、停机、鱼精蛋白中和肝素后和停机后30 min抽取兔血清测量肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素8（IL-8）和丙二醛（MDA）的浓度变化。结果三组光镜下观察均可发现ECC后肺泡壁毛细血管扩张、出血；肺间质及肺泡腔内炎性细胞侵润。组Ⅲ上述改变明显少于其他二组；电镜观察发现可见肺泡Ⅱ型细胞微绒毛大部分消失；板层样小体呈空泡样变。组Ⅰ和组Ⅱ上述改变明显；术后肺组织匀浆中TNF-α含量组Ⅲ明显低于组Ⅰ和组Ⅱ；兔血清中TNF-α和IL-8停机后30 min时组Ⅲ明显低于组Ⅰ和组Ⅱ。无论是肺组织匀浆还是血清中，MDA在三组间术前、后无明显差异。结论乌斯他丁较沐舒坦和抑肽酶能更好地抑制炎性因子的产生。

【关键词】  体外循环；急性肺损伤；乌司他丁

　　Comparison of Different Agents on Lung Protection ofRabbit During the Extracorporeal Circulation
 
　　Abstract: OBJECTIVETo study the lung protection in rabbits  on extracorporeal circulation（ECC） with different agents.  METHODSFiteen adult New Zealand rabbits were divided randomly into three groups,each group 5 rabbits. Group Ⅰ was primed with Ambroxol (30 mg/kg), group Ⅱ with Aprotinin (105 KIU/kg), group Ⅲ with UTI (104 u/kg) in ECC circuit. The lung tissues were obtained for study of histological changes by optical and electronic microscope on pre- and post-ECC. Meanwhile, tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-8 (IL-8) and malondialdehyde (MDA) in lung tissues and plasma were measured on pre-, weaning- and 30 minutes post-ECC.  RESULTS Under the optical microscope, the intraolveolar edema, leukocytes aggregation were seen in all groups,but all of the histological change in group Ⅲ  is not serious as in group Ⅱ and I，especially for the leukocytes aggregation; Under electronic microscope,the diminished lamellar bodies in type Ⅱ alveolar epithelial cells could been seen significantly; TNF-α  and IL-8 in group Ⅲ  is lower significantly than group  Ⅰ and Ⅱ in the lung tissues; TNF-α and IL-8 in group Ⅲ  in plasma is much lower than group Ⅰand Ⅱ on 30 minutes post-ECC. There is no difference for MDA in lung tissues and plasma. CONCLUSIONUTI has more effective inhibition on SIR and protection of lung function than Ambroxol and Aprotinin  in experimented study.

　　Key words：Extracorporeal circulation;Acute lung injury;Ulinastatin

　　体外循环（Extracorporeal circulation，ECC）导致的全身炎性反应（SIR）和急性肺损伤（ALI）严重影响着手术结果。由于认识到ALI的主要因素是SIR，近年来很多学者将一些能有效减轻SIR的药物应用于临床实践中，例如沐舒坦、抑肽酶和乌司他丁。但上述药物都是在临床上单独使用或与常规对照组进行比较。并没有三种药物在同一研究中进行临床效果的比较。更没有动物实验的结果证明那种药物更具临床意义。本研究即通过动物实验比较上述药物对实验动物肺组织的影响。

　　1材料与方法

　　1.1实验动物

　　体重2.0～2.5 kg的纯种成年新西兰大白兔15只(由白求恩军医学校动物实验中心提供)。

　　1.2主要试剂与仪器

　　兔TNF-α和IL-8定量测定采用双抗体夹心ABC-ELISA法。使用兔ABC-1 ELISA试剂盒，美国TPI，晶美生物有限公司分装。德国全自动酶标仪354-00768。 兔丙二醛（MDA）定量测定：试剂盒由南京建成生物工程研究所产品，756紫外分光光度仪、水浴箱、离心机。

　　1.3实验分组

　　将实验动物随机分成三组，即沐舒坦组（组Ⅰ，n=5）,抑肽酶组（组Ⅱ，n=5）和乌司他丁组（组Ⅲ,n=5）。三组分别在ECC预充液中加入沐舒坦30 mg/kg、抑肽酶10万KIU/ kg和乌斯他丁1万U/ kg。

　　1.4实验方法

　　1.4.1一般准备和动物麻醉实验

　　室温度调节在25℃左右。实验兔术前禁食、水6 h 。耳缘静脉置静脉留置针，并确切固定。2.5%硫苯妥钠25～30 mg/kg于耳缘静脉诱导麻醉后，气管内插管，人工呼吸机控制呼吸，潮气量为22～25 ml/kg，频率50～60次/min。耳动脉置管监测动脉压，置电极记录心率和心电图，肛门置体温表记录体温。

　　1.4.2ECC方法ECC流量为70～100 ml/（kg·min），ECC过程中动脉压保持在60 mm Hg以上。由于兔的体重小，预充量尽可能少。手术于前胸部正中切口进胸，切开并悬吊心包，显露心脏。于主动脉根部和右心房作荷包缝线后，置主动脉插管和腔静脉插管。肝素化后开始ECC。ECC至少30 min后停机，鱼精蛋白中和肝素（按1∶1.5）后抽血，至少保证兔自主心跳30 min后。

　　1.5标本采集、检测与处理

　　抽取术前、鱼精蛋白中和肝素后和停机30 min后兔血清检测肿瘤坏死因子（TNF-a）、白细胞介素8（IL-8）和丙二醛（MDA）的浓度变化。

　　取术前和停ECC后30 min的肺组织，一部分制成肺组织匀浆，以备检测各种炎性因子；一部分固定后用做光、电镜检查。肺光镜标本：新鲜肺组织于Bouin溶液中固定48 h以上，脱水、透明、包埋、切片、HE染色。肺电镜标本：新鲜肺组织固定于新近配置的4℃ 2.5%戊二醛溶液中，真空抽出肺内气体。1%饿酸作后固定，Fpon 812包埋，LKB-V型超薄切片机切片；按电镜常规置备标本，半薄切片定位后在行超薄切片。醋酸铀和枸橼酸铅双染色，日立H-7500透射电镜观察。  

　　1.6统计学处理

　　所有数据均经STATA 6.0统计软件处理，采用多因素方差分析，数据以均数±标准差( ±s )表示，P﹤0.05为差异有显著性。

　　2结果

　　术后肺组织病理观察发现大量白细胞聚集在肺间质和肺泡内，最具特征性改变是含有肺表面活性物质的板层小体发生空泡样变，上述改变组Ⅲ明显低于组Ⅰ和组Ⅱ，见图1～6；炎性因子测定表明术后肺组织匀浆中TNF-α和IL-8含量组Ⅲ明显低于组Ⅰ和组Ⅱ(P<0.05)，结果见表1；兔血清中TNF-α和IL-8停机后30 min时组Ⅲ明显低于组Ⅰ和组Ⅱ(P<0.05)。无论是肺组织匀浆还是血清中，MDA在三组间术前和术后无明显差异，见表2。表1 三组兔肺组织匀浆中MDA、TNF-a 、IL-8浓度的比较(略)注：组Ⅰ、组Ⅱ分别和组Ⅲ比较*P<0.05表2 三组兔血浆中MDA、TNF-a 、 IL-8浓度的比较(略) 注：组Ⅰ、组Ⅱ分别和组Ⅲ比较*P<0.05

　　3讨论

　　由于兔具有完整的近于人类体、肺循环系统和肺脏解剖结构，故适宜做各种开胸和心脏实验。兔是最常用的实验动物之一［1］。 在国外，曾经有利用兔进行体外循环实验［2-3］，观察肺高压和肺损伤的变化情况。在国内，仅发现于洋等利用兔做过体外循环试验模型［4］。目前尚未发现与肺损伤和肺保护有关的动物实验文章。

　　由于实验动物体重小，血管壁薄，血容量小，少量出血即可引起血压和心率的改变而影响实验。同时由于兔体重小，对抗手术和ECC创伤的能力小，很容易造成心跳骤停而导致实验失败。本实验表明：实验操作者熟练的操作技术和默契配合，合适的实验设备和手术器具是实验成功的基本要素。

　　ECC导致的ALI和SIRS已被大量临床和实验证明。其中细胞因子激活弹性蛋白酶，引起肺毛细血管通透性增加是导致肺损伤的主要原因［5］。这些细胞因子的水平高低直接反映ECC后ALI和SIRS的严重程度［6］。

　　乌斯他丁(UTI)是一种广谱蛋白酶抑制剂。研究表明乌斯他丁对由于体外循环导致的各种蛋白酶及炎性介质对机体的损伤有明显的抑制作用［7-8］。沐舒坦，药品名为盐酸氨溴索(AMBROXOL)是一种新型呼吸系统药物，可促进肺泡Ⅱ型细胞合成分泌表面活性物质,具有清除氧自由基,减少炎性介质,抗氧化和抗炎作用。抑肽酶也是一种蛋白酶的抑制剂,可以抑制纤溶酶、血管舒缓素、激肽以及补体、溶酶体酶等的激活所致的不良反应。一些研究证明,抑肽酶对体外循环引起的炎性反应有抑制作用。

　　光镜下肺组织观察发现停机后30 min三组均可发现肺泡壁毛细血管扩张、出血；肺间质及肺泡腔内炎性细胞侵润。说明ECC可导致肺组织结构的病理性改变。但组Ⅲ肺间质和肺泡腔内性粒细胞明显少于其他二组,而组Ⅰ和组Ⅱ没有明显差异；电镜下观察术后肺切片可见肺泡Ⅱ细胞微绒毛大部分消失；嗜饿酸性板层样小体呈脱颗粒空泡样变。但组Ⅲ板层样小体呈脱颗粒空泡样变明显少于其他两组。说明乌斯他丁较抑肽酶和沐舒坦有更好抑制炎性因子的释放，具有更好的肺保护作用。肺组织匀浆中TNF-α含量组Ⅲ明显低于组Ⅰ和组Ⅱ；实验动物血清中TNF-α和IL-8停机后30 min时组Ⅲ明显低于组Ⅰ和组Ⅱ，组Ⅰ和组Ⅱ则无明显差异。说明乌斯他丁较抑肽酶和沐舒坦能更好地抑制炎症因子的释放。需要说明的是实验中三组在MDA上并没有显著性差异。

【】
  　　［1］施新献.医学实验动物学［M］.人民军医出版社,2000,102-118.

　　［2］Fountain S W,Martin B A,Musclow CE,et al. Pulmonary Leukostasis and its relationship to pulmonary dysfunction in sheep and rabbits［J］.Circ Res,1980,46: 175-180.

　　［3］Cave AC,Manche A,Derias NW,et al.Thromboxane A2 mediates pulmonary hypertension after cardiopulmonary bypass in the rabbit［J］. Thorac Cardiovasc Surg,1993,106:959-967.

　　［4］于洋,叶明,夏求明. 兔体外循环模型的建立［J］.心血管外科临床杂志,2003，2：151-152.

　　［5］Kirklin J K,Westabys,Blackstone E H,et al. Complement and damage effects of cardiopulmonary bypass［J］. Thorac Cardiovasc Surg,1983,86: 845-857.

　　［6］侯晓彬，肖明第. 全身炎症反应综合征与体外循环.中国体外循环杂志，2004,2:119-121.

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