反复体外受精-胚胎移植失败的患者T辅助细胞免疫应答方式的研究
作者：杨桂艳，姜英华，吴洪秋，曾伟荣
【关键词】 T辅助细胞
摘要：目的：研究不明原因反复体外受精―胚胎移植(试管婴儿，IVF-ET)失败的患者机体T辅助细胞1（Th1）及T辅助细胞2(Th2)免疫应答方式，为不明原因反复体外受精-胚胎移植失败提供理论依据。方法：将不明原因的三次及三次以上IVF-ET失败的患者作为研究对象，一个周期IVF-ET成功妊娠的患者作为对照组，抽取非治疗周期静脉血分离单个核细胞并于37℃，5%CO2培养箱中培养72h，分离上清，ELISA法测定上清液中INF-γ/IL10含量，INF-γ/IL10的比值，从而反映机体Th1、Th2细胞的免疫应答方式。结果：反复IVF-ET失败的患者9例中有7例TH1细胞因子（INF-γ）浓度是Th2细胞因子（IL10）的3倍，有显著性差异；反复IVF-ET失败的患者9例中有4例机体Th1细胞因子（INF-γ）是Th2细胞因子（IL10）的9倍，呈Th1强势反应，而对照组9例中仅1例且发生早期流产，有统计学意义。结论：部分反复体外受精-胚胎移植失败的患者机体Th1 Th2免疫应答失衡，呈Th1优势反应，提示细胞免疫过强。
关键词： 反复体外受精-胚胎移植失败； T辅助细胞； 优势反应
Study on T Helper Cell Immune Response Type in Women with Unexplained Recurrent IVF-ET Failure
Abstract： Objective：To study the Th1 and Th2 response type in women with unexplained recurrent IVF-ET failure, and to provide theoretic evidence on dealing with recurrent IVF-ET failure. Method： Blood sample was taken from 9 women received 3 unexplained failure IVF-ET cycles (study group), while 9 women with successful IVF-ET cycle being controlled. The lymphocyte was separated, and then was cultured at 37℃，5%CO2 for 72 hours, concentration of INF-γ,IL10 was measured by ELISA，the INF-γ/IL10 rate was calculated. Result： 7 from 9 in study group had INF-γ/IL10 rate more than 3, while only 2 from 9 in control group and 4 from 9 in study group had INF-γ/IL10 rate more than 9, while only 1 from 9 in control group and the patient got early abortion. Conclusion： Large partial women with unexplained recurrent IVF-ET failure had T helper cell immune respond imbalance. Th1 cytokines was strong response in large partial women with unexplained recurrent IVF-ET failure, and it was obvious in some patients.
Key words： Reccurent unexplained IVF-ET failure； T helper cell； Strong response
体外受精-胚胎移植是一种有效的使输卵管阻塞、男方少弱精及各类难治性不孕症夫妇喜得后代的技术，其一个治疗周期的妊娠率达40%左右，累计妊娠率高达80%，已知的反复植入失败的原因有：年龄过大卵子老化、卵巢反应不良可供选择的优质胚胎少、子宫内膜严重受损、输卵管积水等，但也有一些患者虽然植入优质胚胎、子宫内膜正常、染色体检查正常仍然反复种植失败，有学者认为与机体的免疫状态有关，因此我们研究了反复不明原因种植失败的患者血清中单个核细胞的INF-γ/IL10的含量及比值了解 T 辅助细胞的免疫应答方式，介绍如下：
1 材料与方法
1.1 研究对象：选自2004年1月至2005年10月因输卵管阻塞、男方少弱精来我院行体外受精-胚胎移植的患者，研究组9例：选择三次体外受精―胚胎移植失败的患者；对照组9例：选择第一次行体外受精-胚胎移植成功妊娠的患者。所有患者排除输卵管积水、子宫内膜受损、卵巢反应不良等明显影响成功种植的因素并且移植的胚胎质量优良，排除染色体、解剖、内分泌异常及感染、自身免疫性疾病如类风湿关节炎、甲状腺疾病、红斑狼疮等。两组年龄分别为34.3±4.7岁及33.1±4.4岁,无显著性差异。
1.2 研究方法：10ml静脉血抗凝，淋巴细胞分离液梯度离心分离单个核细胞，加入含5% 人血清白蛋白及植物血凝素的1640培养液1ml，将淋巴细胞浓度调节至2×106/ml，置37℃，5% CO2的培养箱中培养72h，分离上清，于-70℃低温冰箱保存待测。INF-γ／IL10试剂盒购于深圳晶美工程有限公司，采用双抗体夹心ELISA法测定标本中INF-γ|IL10的含量（标本按1：8稀释）。
1.3 统计学处理：采用X2检验 。
2 结果
2.1 IFN-γ/IL-10>1：研究组9例中7例（77.77%），而对照组9例中仅4例（44.44%）,其中1例发生早期流产（No.2），P>0.05。
2.2 IFN-γ/IL-10>3：研究组9例中7例（77.77%），而对照组9例中仅2例（22.22%）,其中1例发生早期流产（No.2），P<0.05。
2.3 IFN-γ>9倍IL-10：研究组9例中4例（44.44%），而对照组9例中仅1例（11.11%）,发生早期流产（No.2），P>0.05，见表1。
表1 各标本IFN-α与IL-10的含量（略）
3 讨论
体外受精―胚胎移植是有效的难治性不孕的技术，其费用高成功率低令患者忧心忡忡，如何提高成功率长期以来是生殖医生及胚胎学家探讨的主要问题，如囊胚移植、培养液及移植管的改进、移植方法改良等使成功率有所提高，但仍在40%左右徘徊，不能有所突破。尤其是反复体外受精-胚胎移植失败的患者，通过切除输卵管积水、宫腔粘连分离等手段使一部分患者成功妊娠，但仍有相当一部分的患者多次的取卵移植虽然有评分很高的优质胚胎仍然不能如愿以偿，作者认为可能与机体的免疫状态异常有关。
机体免疫效应类型主要分为细胞免疫和体液免疫两类，两者之间的协调依靠调节性T细胞来维持，根据分泌的细胞因子不同，T辅助细胞分为Th1细胞及Th2细胞，前者分泌IL2及IFN-γ，后者分泌IL6及IL10,分别调节细胞免疫和体液免疫，这两类细胞通过分泌不同的细胞因子交互调节维持Th1/Th2间的动态平衡，如某种因素打破了这一平衡则可能导致与免疫有关的疾病，如类风湿关节炎、红斑狼疮、甲状腺疾病等。近年来有学者研究反复不明原因流产的患者机体T辅助细胞失衡，呈Th1强势反应，并认为通过夫血淋巴细胞主动免疫可重新调节Th1/Th2间的平衡，下调Th1型细胞因子，上调Th2型细胞因子［1，2］，从而有效的治疗不明原因反复性流产。本文作者由此得到启发，推测不明原因的反复的优质胚胎的种植失败可能是因为发生了早期的流产，在种植的10d之内发生了免疫排斥。我们通过测定反复的不明原因种植失败的患者的血单个核细胞分泌IFN-γ和IL-10的含量得出以下结论：反复的不明原因种植失败的患者9例中有7例（77.77%）呈TH1细胞强势应答，表现为IFN-γ与IL-10的比值大于3倍以上，而对照组9例中仅2例（22.22%） 的患者呈Th1细胞强势,有显著性差异；在研究组中有4例（44.44%）IFN-γ含量高于IL-10九倍以上，而对照组仅1例，且发生了流产。
众所周知，胚胎是同种半异体抗原，在体外受精-胚胎移植过程中，数个优质胚胎被直接移植入子宫，其是否能够在母体子宫内生存、生长和发育而不被排斥，除了胚胎本身的发育潜能、染色体外其中发生在母胎界面的免疫也起着一定的作用。近年来许多学者用Thl/Th2型细胞因子的调节机制研究母胎界面的免疫。Kent发现Th1型细胞因子干扰滋养细胞的侵蚀，抑制子宫内膜蜕膜化［3］。反复自然流产妇女蜕膜细胞产生过量胚胎毒性细胞因子，Thl/Th2平衡偏向Thl，而Thl类细胞因子对胚胎有害，Th1型细胞因子可引起自然杀伤细胞的活化浸润，导致胎儿死亡，诱发妊娠早期人绒毛滋养细胞凋亡［4］。Th2细胞因子被认为是免疫调节性因子，下调Thl反应，诱导母体对胎儿同种移植产生免疫耐受，IL10可能是促进成功妊娠滋养层生长的自然反应，可减弱胎儿组织的人白细胞抗原I和II类分子的表达，保护胎儿免遭母体免疫系统的排斥［5］。
本研究提示，Th1的强势反应可能是不明原因反复体外受精-胚胎移植失败的原因之一，有必要扩大样本排除混杂因素进行进一步的研究。夫血淋巴细胞主动免疫是否对部分反复失败的患者有利、是否可以下调这类患者Th1型细胞因子是值得进一步探讨的问题。
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［1］ 赵爱民，林其德.Th1/Th2细胞因子与复发性流产相关［Ｊ］．上海第二医科大学学报，2000，20 suppl:351-352.
［2］ 邱丽华，林其德，洪燕，等．原因不明习惯性流产患者主动免疫治疗前后T辅助细胞1、2型细胞因子的变化［Ｊ］.中华妇产科杂志，2001，36（7）：408-410．
［3］ kent AS, Sulivan MH, Sun MY, et al. Effect of interleukin 6 and tumor necrosis factor α on prostagland in production by cultured human fetal membranes［J］.Prostaglandins,1993,46(4):351-359.
［4］ 邢福祺，孔令红，陈士岭，等．肿瘤坏死因子和干扰素诱导人绒毛膜滋养细胞凋亡的研究［J］.中华妇产科杂志，1999,34(8): 476-478.
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