Tob mRNA在结直肠癌组织表达的临床病理学意义
【关键词】 结直肠癌
摘 要：目的：研究Tob mRNA在结直肠癌组织及其相应的癌旁正常组织的表达，探讨其在结直肠癌发生中的作用。方法：用荧光定量RT-PCR方法，检测38例结直肠癌标本及其相应的癌旁正常组织Tob mRNA的表达。结果：38例癌组织Tob mRNA表达高于癌旁正常组织（P<0.005）； Tob mRNA表达随着Dukes分期有增高趋势，差异有统计学意义(P<0.005)。结论：在结直肠癌的发病机制中，Tob mRNA可能为致癌基因。
关键词： 结直肠癌； Tob mRNA
Association of Tob mRNA Expression with Clinicopathological Characteristics of Colorectal Cancer
Abstract： Objective： To investigate the expression of Tob mRNA in human colorectal cancer tissues, and their corresponding para-cancerous tissues , and to investigate the role of Tob mRNA in the pathogenesis of colorectal cancer. Method： Quantitative real time RT-PCR was used to detect the expression of Tob mRNA in 38 colorectal cancers. Result： Compared to those from corresponding normal tissues the expression of Tob mRNA in colorectal cancer tissues were significantly increased. Moreover, the expression value of Tob in Dukes A,B,C,D was 8.32±1.90, 6.90±1.43, 6.01±1.25 and 3.48±0.69，respectively. Analyzed by one-way ANOVA,there were significant differences in the expression of Tob in defferent Dukes stage. Conclusion： The up-regulation expression of Tob mRNA may be closely associated with tumorigenesis of colorectal carcinoma.
Key words： Colorectal cancer； Tob mRNA
Tob基因是抗增殖基因，可抑制细胞的增殖［1］，最近的研究表明：在肺癌的发病机制中Tob可能为抑癌基因［2］。但是，结直肠癌组织Tob基因的表达情况国内外未见报道。基于此，我们采用荧光定量 RT-PCR技术检测了38例结直肠癌、癌旁正常组织Tob mRNA的表达，并初步探讨其参与结直肠癌发生发展的机制。
1 材料与方法
1．1 材料：38例癌组织及相应的癌旁正常组织（距肿瘤10cm以上）取自我院2003年7月至2005年1月外科手术切除的大肠癌新鲜标本，均经病理证实。患者年龄35～76岁，平均56岁；男17例，女21例。根据Newland（1981）Dukes分期法， A期9例，B期17 例，C期8 例，D期4例。所有病例术前均未经过放疗和化疗。组织取材后立即放入液氮内冷冻，－70℃冰箱保存。
1.2 试剂及仪器：Trizol试剂盒 (GIBCO,USA) ,RT-PCR 试剂盒(MBI公司), PCR 试剂盒(MBI 公司)，DEPC（GIBCO,USA）, dNTP(MBI 公司)，GAPDH内对照试剂盒(ABI,USA)，FTC2000实时荧光定量基因扩增仪（枫岭公司，加拿大）。
1.3 引物设计：Tob基因上游引物：5’－CCAGTACAGTAATGCCTTTGATGT-3’,下游引物：5’－CCGTGCATTTTAACTTGTACGAT-3’, 探针：5’－CATTGAGGCCTCCATAGGCTGC-3’,内参照GAPDH上游引物:5’- GGCATGGACTGTGGTCATGA-3’,下游引物5’－ TGGGTGTGAACCACGAGAAC－3’，探针：5’－ CTGCACCACCAACTGCTTAGC－3’， 上述引物由上海生物工程技术服务公司合成。
1.4 总RNA提取及cDNA制备：按照TRizol试剂盒说明提取结直肠癌组织、癌旁正常组织总RNA，RNA纯度为：OD260/OD280>1.8。每个总RNA样品取5μl，加1μl（0.2μg/μl）随机引物，加6μl DEPC水，混匀后瞬时离心，70℃变性5min，冰上冷却5min，加入4μl 5×逆转录缓冲液、2μl 10mmol/LdNTP混合物、1μl RNA酶抑制剂、1μl反转录酶，反应终体积为20μl，20℃反应5min、42℃反应60min、70℃反应5min，冰上冷却后置于－20℃贮存备用。
1.5 荧光定量PCR反应：依次取10×PCR缓冲液3μl、25mmol/L MgCl2 3μl、25mmol/L dNTP 0.36μl、5’和3’引物各1μl、TaqMan探针 1μl（10μmol/L）、Taq 酶（5u/μl）0.3μl、ddH2O 18.34μl 、模板cDNA 5μl加入0.5ml EP管至终体积30μl。94℃预变性2min。然后按94℃ 20s、53℃ 30s、60℃ 60s进行45个循环的PCR反应，53℃30s收集荧光。
1.6 定量分析：用Tob mRNA Ct 值/内参照GAPDH Ct值代表Tob mRNA的精确含量。
1.7 统计学处理：Tob 基因表达以均数±标准差表示，用SPSS11.5统计软件统计，配对t检验及单因素方差分析，以P＜0.05认为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 根据定量荧光PCR原理Ct值与扩增片断的实际拷贝数呈反比，即Ct值越低，实际含量越高。结直肠癌组织Tob mRNA表达值为6.89±1.90高于癌旁正常组织(7.84±2.00, p<0.005) 。
2.2 Tob mRNA表达与临床病理特征的关系：结直肠癌组织Tob mRNA表达随着Dukes分期越晚其表达有增高趋势，淋巴结转移组结直肠癌组织Tob mRNA的表达高于无淋巴结转移组癌组织，但Tob mRNA表达与患者的性别、年龄、肿瘤的分化程度无关。（表1)
3 讨 论
结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤，其发生是一个多步骤、多阶段及多基因参与的疾病，癌基因和抑癌基因表达失衡可导致肿瘤的发生［3］。认识大肠癌分子水平的改变将有助于结直肠癌的筛选、诊断、预后的判断和基因。
Tob基因是抗增殖基因，可抑制细胞的增殖，最近的研究表明：在肺癌的发病机制中Tob可能为抑癌基因。我们用荧光定量 RT-PCR方法检测了38例结直肠癌组织及癌旁正常组织Tob mRNA表达。结果表明TobmRNA在结直肠癌组织的表达明显高于癌旁正常组织，且随着Dukes分期越晚Tob mRNA表达越高，这提示Tob mRNA高表达促进了结直肠癌的发生和浸润，其生物学功能表现为致癌基因，可能是结直肠癌的检测指标之一。Tob mRNA在结直肠癌的表达和肺癌不同，可能和同一基因在不同肿瘤组织中具有不同的生物化学功能有关，因为肿瘤的发生发展是复杂的多基因、多步骤的一系列分子事件［3］。同样的情况还见于磷脂结合蛋白AnnexinⅠ，其在乳癌、肝细胞癌为高表达而在食管癌和前列腺癌低表达［4～7］。周期素依赖激酶抑制因子p21在大部分肿瘤中是抑癌基因，但在一些肿瘤中如食管鳞状细胞癌，p21过度表达促进了肿瘤的发生发展，其生物学功能表现为致癌基因［8］。
综上所述，Tob mRNA在大肠癌的形成过程中可能为致癌基因。但Tob基因在恶性肿瘤形成中的作用机制尚不完全清楚，有待进一步研究。
表1 Tob mRNA表达与临床病理特征的关系（略）
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