脑胶质瘤中p16蛋白的表达及临床意义
【关键词】 脑胶质瘤
摘要：目的：研究抑癌基因p16蛋白在脑胶质瘤发生、分化过程中的作用及其与预后的关系。方法：本院1999年6月至2002年6月接受手术及术后立体定向放射68例脑胶质瘤患者，应用免疫组化的方法检测其病理标本中的p16蛋白，分析p16蛋白的缺失与病理分级、患者预后之间的关系。结果：全组共有37例（54.4%）标本p16蛋白表达阴性，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤的p16蛋白表达阴性率分别为14.3%、33.3%、66.7%、75.0%，Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤的p16蛋白的阴性率明显高于Ⅰ、Ⅱ级（P<0.01）。p16蛋白表达阴性患者的复发率明显高于p16蛋白表达阳性者（P<0.01），分别为54.5%和19.4%。结论：p16蛋白的缺失与脑胶质瘤的恶性程度有关，恶性程度越高，p16蛋白的缺失率越高；p16蛋白的缺失与预后相关，其缺失率越高，患者复发率越高。
关建词：脑胶质瘤；p16蛋白；外科手术；立体定向放射治疗
p16 Expression and Clinical Signficance in Brain Glioma
Abstract： Objective: To investigate the correlation of p16 expression with the proliferation, malignant progression and prognosis of brain glioma. Method：68 patients of brain glioma were operated with stereotactic radiotherapy after operation from June 1999 to June 2002. Express of p16 protein of the specimens was detected by immunohisto- chemistry. The relationship between the expression of p16 protein and the pathological grade and the recurrence of the tumor were analyzed. Result： There were 37cases (54.4%) that the expression of p16 protein was positive. The positive rate of Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ pathological grade was 14.3%、33.3%、66.7% and 75.0% respectively. The positive rate of Ⅲ and Ⅳ grade was significantly higher than Ⅰand Ⅱ grade.（P<0.01） The recurrence rate of patients with negative expression of p16 protein (54.5%)was significant higher than the those with positive negative expression(19.4%). Conclusion： The loss or mutation of p16 gene is one of the reasons of the malignant progression in brain glioma. The immunohistochemical detection of p16 protein acts as a prognosis index for brain glioma.
Key words：Glioma;p16 protein;Operation;Stereotactic radiotherapy
p16基因（MTS1，CDK4I，CDKN2）是近年发现的一个抑癌基因，是细胞周期调控基因家庭中的重要成员之一，其功能蛋白能特异地抑制CDK4/CDK6的活性，间接阻断处于分裂周期的细胞从G1期向S期转变，抑制细胞增殖［1］。在多种肿瘤细胞系及临床肿瘤标本中，p16基因都有着高频率的缺失及突变，并以脑胶质瘤细胞为最高，达82%［2］，显示了它在脑胶质瘤恶性转化中的重要作用。因此，研究p16基因对脑胶质瘤的作用，对于提高脑胶质瘤诊断和治疗水平都具有重要的意义。
1材料与方法
1.1材料：1999年6月至2002年6月，本科共收治68例初治的脑胶质瘤患者，所有患者均接受开颅肿瘤切除手术，及术后立体定向放射治疗。患者中位年龄47岁（32～69岁）；其中男性46例，女性22例，男：女为2.1：1。胶质瘤按Kernohan［3］分级标准：Ⅰ级7例、Ⅱ级18例，Ⅲ级27例、Ⅳ级16例。
1.2方法：切片常规脱蜡至水,微波修复抗原，3%双氧水灭活内源性过氧化物酶，正常血清封闭，滴加ｐ16单抗（美国Santa Cruz公司产品）或鼠抗人PC10单抗（美国Sigma公司产品），浓度为1：50，阴性对照以PBS替代，20℃～37℃ 1～2ｈ或4℃过夜。此后滴加SABC试剂（购于武汉博士德生物工程公司），20℃～37℃20min。DAB显色(购于武汉博士德生物工程公司)，苏木精轻度复染。显微镜下观察结果或照像。ｐ16阳性细胞为细胞核及细胞质呈黄色或棕黄色着色。放射治疗采用分次立体定向放射治疗（Fractionated Stereotactic Radiotherapy，FSRT）,靶区由CT增强区及其周围2～4mm所括及的范围确定，以80～90等剂量线定义靶区周边剂量,每周照射2～3次，每次剂量5～11GY（中位剂量8GY），共行3～9次，总剂量为21～50GY（中位剂量39GY）。治疗结束后每隔3个月行影像学复查，患者复发以头颅CT作为主要诊断指标，同时结合患者的临床表现。
1.3随访：生存期自治疗开始之日起，所有患者均随访至2004年6月30日，全组中位随访期为27月（24～36个月）。
1.4统计分析：各组间的比较采用卡方检验。
2结果
2.1p16蛋白表达与脑胶质瘤病理分级之间的关系：全组68例中有37例（54.4%）p16蛋白表达阴性，病理分级为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中p16蛋白表达阴性率分别为14.3%、33.3%、66.7%、75.0%。统计结果显示Ⅰ级与Ⅱ级之间，Ⅲ级与Ⅳ级之间缺失率差异无意义，Ⅲ、Ⅳ级缺失率明显高于Ⅰ、Ⅱ级（P<0.01），见表1。
表1病理分级与p16蛋白表达之间的关系（略）
表2p16蛋白表达与复发率之间的关系（略）
2.2p16蛋白表达与复发率之间的关系：全组68例中有26例复发，死亡11例。其中p16蛋白阳性表达患者中有6例复发，复发率为19.4%；死亡2例，生存率为93.5%（29/31）。p16蛋白阴性表达者中有20例复发，复发率为54.1%；死亡9例，生存率为75.7%（28/37）。统计结果显示p16蛋白表达阴性患者的复发率明显高于p16蛋白达表阳性者，（P<0.01），见表2。
3讨论
目前认为，p16基因的主要作用是特异性地抑制细胞周期素K（cyclin D）―细胞周期素依赖性激酶（CDK）复合体，从而调控细胞由G1期到S期的转变，当细胞由于某种原因p16基因缺失或失活，cyclin D-CDK复合体持续高活性的存在于细胞内，进而导致Rb蛋白的磷酸化，并释放转录因子E2F等，从而激活其他细胞增殖相关基因，造成细胞从G1期到S期不受控特性，从而导致细胞的恶性增殖［4，5］。国外研究已经发现在低级别的胶质瘤中ｐ16的缺失表达常不存在或呈低表达，而在间变性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中的缺失表达比率则明显升高，且呈递增趋势［6，7］。国内学者的研究结果证实了上述观点［8］。本研究应用免疫组织化学方法，检测了68例脑胶质瘤标本的ｐ16蛋白表达情况，结果提示高分级的脑胶质瘤其p16蛋白表达的阴性率明显高于低分级的脑胶质瘤，脑胶质瘤的病理分级越高其p16蛋白的缺失率越高，这提示ｐ16基因异常可能与脑胶质瘤的发生及恶性进展有关。此外，本研究结果还显示p16蛋白表达阴性的患者其复发率明显高于p16蛋白表达阳性者，提示p16基因异常与患者预后密切相关。在临床实践中,我们常常发现同一病理级别的脑胶质瘤患者其预后相当悬殊,从病理组织学角度难以解释。从表2我们可以看出处于同一病理级别的脑胶质瘤其p16蛋白表达阴性者的复发率均高于p16蛋白表达阳性者（但由于病例数太少，没有统计学意义）。以上结果说明ｐ16蛋白缺失的脑胶质瘤患者更易复发，预后更差。ｐ16蛋白免疫组织化学检测在临床上有着重要的实用价值，其方法简单、方便，可作为1个反映脑胶质瘤的增殖能力及恶性进展可能性的指标，在指导临床方案的选择及预后的判断等方面有着重要的实用价值。最后，由于p16基因能够抑制胶质瘤细胞的生长，这为进一步深入研究p16基因的临床治疗提供了实验依据。
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