中国保安族线粒体 DNA D
【关键词】 序列多态性
Polymorphism of mitochondrial DNA Dloop region in Chinese BAOAN ethnic group
【 Abstract】AIM: To investigate the mitochondrial DNA sequence polymorphism in Chinese BAOAN ethnic group and to provide basic data for ethnic origin investigation and forensic purpose. METHODS: Genomic DNA was extracted from the whole blood of 98 unrelated individuals of Chinese BAOAN ethnic group by standard chelex100 method. The sequence polymorphism was determined by PCR amplification and direct sequencing. RESULTS: Sixtysix polymorphic sites and 62 haplotypes were identified in mtDNA Dloop region (np1609116418) . The genetic diversity was calculated to be 0.9862, and the genetic identity was 0.0237. CONCLUSION: There are some particular polymorphism sites in Chinese BAOAN ethnic group, and these sites provide an important basis to investigation of the origin of BAOAN and the relationship between BAOAN and other ethnic groups. The result also suggests that sequence polymorphism (np1609116418) in human mitochondrial DNA can be an useful tool for forensic identity.
【Keywords】 mitochondrial DNA; sequence polymorphism; Dloop region
【摘要】 目的： 以遗传群体为对象，观察线粒体DNA的群体遗传特点，为研究西北少数民族的起源提供依据，并为法医学鉴定提供线粒体DNA序列多态性的基础数据. 方法： 应用 PCR 扩增产物直接测序法，对98例保安族无关个体线粒体DNA D环区HVSⅠ进行测序分析. 结果：在mtDNA高变区Ⅰ（HVSⅠ）16091~16418之间与Anderson序列比较共发现有66处碱基突变，62个单倍型. 碱基突变的主要形式为碱基替代，其中转换87％,颠换11％，碱基插入1%,碱基缺失0.5%. 保安族线粒体DNA HVSⅠ区基因差异度为0.9862，偶合概率为0.0237. 结论： 保安族与其他群体比较有其独特的线粒体DNA序列遗传特点，与亚洲其他人种及高加索人种有明显差异. 保安族线粒体DNA序列多态性不仅有别于西方人种,也与其他东亚人种不同. 线粒体DNA控制区HVSⅠ序列多态性可用于法医学个体识别及亲权鉴定.
【关键词】线粒体DNA；序列多态性；D环区
0引言
线粒体DNA(mtDNA)是一个闭合环状、有16569个碱基的双链分子［1］. 其非编码区(也称控制区,Dloop区)位于tRNAPro和tRNAPhe基因之间，大约1100碱基，包括两个高变区（HVSⅠ和HVSⅡ）. 在非编码区,尤其是两个高变区,mtDNA存在着高度序列多态性，同时每个细胞有103～104个mtDNA拷贝,已被广泛应用于法医个体识别和亲权鉴定，特别对于腐败和降解的标本以及毛发、骨骼等生物检材的检验具有独特作用. 我国西北地区的少数民族由于受环境及宗教信仰的限制,各部族之间保持了相对的独立性. 但许多少数民族没有自己本民族的文字，故对其民族起源一直没有可靠的文字证据. 我们以我国独特的少数民族群体为研究对象，观察mtDNA的群体遗传特点，为研究少数民族起源提供遗传学证据，也为法医鉴定提供mtDNA序列多态性的基础数据.
1对象和方法
1.1对象98例保安族样本均采自甘肃省临夏州积石山县，每个提供血样的无关个体均身体健康，并追溯3代以上，以保证其民族代表性.
1.2方法
1.2.1DNA提取加5 μL经EDTA抗凝的血样于加有1 mL去离子水的1.5 mL离心管中,置摇床上摇20 min，离心2 min，弃上清；沉淀物加入5 mol・L-1的chelex溶液200 μL，振荡10 s，56℃水浴20 min，100℃干热8 min，振荡10 min，离心2 min，4℃保存备用.
表198例保安族无关个体mtDNA HVSⅠ区碱基突变及单倍型 (略)
1.2.2mtDNA扩增与纯化根据mtDNA标准序列，自行设计引物如下：H5′CAT GGG GAA GCA GAT TTG3′；L5′TTA GCT ACC CCC AAG TGT3′. PCR扩增体系50 μL，包括3′端及5′端引物各12.5 pmol，10×PCR缓冲液5 μL， 75 mmol MgCl2，40 nmol dNTPs， 33.3 nKat Taq DNA聚合酶及1 ng DNA模板. 用去离子水补足50 μL. 循环参数为95℃预变性3 min 20 s, 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸1.5 min, 35个循环，72℃延伸7 min (PE9600). 扩增产物用10 g・L-1琼脂糖凝胶电泳10 min，检测后用Wizard 纯化试剂盒（美国Promega 公司）纯化.
1.2.3测序及序列分析测序PCR反应体积为20 μL，包括引物1.3 μL（2.5 mmol・L-1），混合物8.0 μL，纯化PCR产物200 ng. 循环参数为96℃变性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸4 min，25个循环. 测序产物经沉淀用ABI PRISM 377自动测序仪进行测序电泳，得到各检材的mtDNA序列. 用SeqEdv1.0.3比对软件与Anderson标准序列比较.
2结果
在mtDNA HVSⅠ 16091~16418之间与Anderson序列比较共发现有66处碱基突变（Tab 1）. 98个个体共有396个点突变，平均每个个体有4个点突变. 碱基突变类型中碱基转换346个，占碱基突变的87%；碱基颠换44个，占碱基突变的11%；碱基插入1%；碱基缺失0.5%（Tab 2）. 突变的热点部位出现在16183，16189,16223和16362，其突变频率分别为19%，21%, 60%和43% (Tab 3). 16180~16194之间有10种不同的序列类型(Tab 4)，其中62.2%与标准序列一致. 98例样本中共发现62个单倍型（Tab 1），按照基因差异度［2］ h=(1-∑x2)n/(n-1)（x为单倍型频率，n为样本数）保安族HVSⅠ区基因差异度为0.9862，按照偶合概率［2］p=∑x2 计算保安族HVSⅠ区偶合概率为0.0237.
表2－表4 (略)
3讨论
3.1保安族演变保安族是我国特有的少数民族，主要分布于甘肃省、青海省和新疆维吾尔自治区，根据我国第3次人口普查，1982年全国共有保安族人口9017人，92.3％居住在甘肃省境内. 据史书记载，1227年，成吉思汗率领的蒙古军队灭西夏，占领了包括同仁在内的河州地区，从此，这里就成为兵家过往的要道和沟通内地与西域贸易的据点. 蒙古军队中的色目人组成的“探马赤军”和“各色技术营”的人住扎在隆务河畔，亦兵亦农，并成家立业，成为保安族的先民，后与蒙古、藏、土、回、汉等民族融合中逐渐形成了保安族. 大约在清咸丰末年到同治初年（1861/1862），由于部落争斗，较为弱小的保安族被迫从他们先民世世代代居住的青海同仁历时5年举族东迁至甘肃的积石山下的大河家. 由于保安族和其临近的东乡、裕固族一样，没有自己本民族的文字，因此，对其民族起源自今尚无有说服力的客观证据. mtDNA由于其严格的母系遗传、无重组以及进化速率高等特点，是研究民族起源较理想的遗传标记.
3.2保安族与其他群体mtDNA序列差异研究发现，保安族个体mtDNA碱基突变的主要形式为碱基转换，这个结果支持了mtDNA 的突变是由于DNA在复制时错配所造成［3］. 在控制区HVSⅠ区段,热点突变主要集中在np16223及np16362位置,这两处碱基在日本人［4，5］、朝鲜人［6］、汉族［4］、中国裕固族及保安族群体中有比较高的突变率，而在法国高加索人［7］及英国高加索［8］人群中突变率较低，表明np16223及np16362碱基突变具有东亚人种的特点. 从Tab 3结果可以看出,有些突变位点有明显的东、西方人种特点. 有些位点在东亚人中不同族群间也存在差异,如np16093位置T→C碱基转换率在保安族达到30%，而在东亚人其他族群中该部位突变率却很低，尤其是与其生活在同一地域，关系非常密切的裕固族，在该部位的碱基转换率仅为6％.
mtDNA 控制区HVSⅠnp16180~np16194位置有一连串C的长度及序列多态性区域,标准序列中np16189为碱基T,当该部位出现T→C碱基转换后,就会出现一连串的10次以上的C重复(polyC),polyC的长度及序列由于受到碱基插入、缺失、转换、颠换等影响，个体之间出现序列多态性. 从Tab 4可以看出,polyC序列变化类型出现频率在各族群之间存在差异,38种类型中，2种为新发现的类型,这两型的特点是在np16193~np16194之间插入了两个C,这种少见的突变类型由于其在个体内发生率低,因而对个体识别很有意义. 共发现中国保安族10种序列变化类型，日本人［4］有16种，朝鲜人［6］19种，而裕固族仅有6种. 表明各民族在进化过程中，保留了本民族独特的遗传特点. 这种mtDNA遗传上的相对独立性，加之其母系遗传的特点，为研究民族起源及与周边民族的关系提供了重要的证据.
3.3mtDNA序列多态性在法医学上的应用mtDNA Dloop区由于其属于非编码区，在遗传过程中选择压力小，突变率高，尤其在HVSⅠ，不仅人群与人群之间有明显差异，而且每一人群的无关个体之间也存在差异［9］. 研究表明，HVSⅠ区np16180～np16194也具有高度多态性. 保安族HVSⅠ基因差异度和单倍型偶合概率可以作为良好的遗传标记进行个体识别.
致谢：本实验得到西安交通大学陈腾博士、郑海波主管技师、北京市公安局法医中心物证室刘雅诚教授、张庆霞、高峻薇法医师以及西安交通大学第一郭佑民教授、赵乐医师提供的无私帮助.
【】
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