针刺对脑缺血大鼠神经元凋亡的影响

【摘要】  目的 观察针刺对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后海马神经元内细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶4(CDK4)和神经元凋亡的影响。方法 大脑中动脉线栓法建立脑缺血再灌注损伤模型，再灌后针刺大鼠，应用免疫组化、免疫印迹法和流式细胞计数法分别检测CDK4和细胞凋亡。结果 缺血组再灌注48h后海马CDK4表达升高，凋亡细胞增多，针刺组CDK4表达和凋亡细胞明显减少(P<0.01)。结论 针刺对脑缺血再灌注损伤有保护作用，其机制可能与调控细胞周期因子从而抑制凋亡有关。

【关键词】  针刺;脑缺血;细胞周期;凋亡

　　ABSTRACT：Objective To investigate the effects of acupuncture on expression of CDK4 protein in neurons and neuronal apoptosis after focal cerebral ischemia reperfusion in rats.Methods A model of middle cerebral artery occlusion(MCAO) in rats was established with intraluminal filament occlusion.Acupuncture was conducted on rats after reperfusion.The immunohistochemistry,western blot and flow cytometry were used respectively to detect the expression of CDK4 protein and neuronal apoptosis in hippocampus.Results A significant increase in CDK4 immunostaining and apoptotic neurons was detected at 48h after reperfusion.The differences of immunoreactivity of CDK4 and apoptotic neurons between ischemic group and acupuncture group were significant(P<0.01).Conclusion Acupuncture can protect cerebral tissues by regulating cell cycle factors and inhibiting cell apoptosis in ischemia reperfusin injury.

　　KEY WORDS：Acupuncture;Cerebral ischemia;Cell cycle factor;Apoptosis

　　海马与学习、记忆、动机及情绪等功能密切相关。局灶性脑缺血可损伤远隔部位的海马出现神经元丢失及神经胶质细胞增殖[1]，形成一种类似海马硬化的病理改变。海马神经元丢失是引发认知障碍的基础病理变化之一[2]。针刺对脑缺血再灌注损伤有保护作用。在脑缺血再灌注损伤中，细胞周期与神经元凋亡有着密切的关系。本研究旨在探讨针刺是否通过对细胞周期的调控发挥抗凋亡作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 试验动物和分组

　　成年健康雄性SD大鼠36只，体质量200～250g，清洁级，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。随机分为对照组、缺血组和针刺组，每组12只。

　　1.2 大脑中动脉闭塞(MCAO)再灌注模型的建立

　　参照Koizumi等[3]方法制作大鼠左侧大脑中动脉阻塞及再灌注模型。采用10%水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉, 术中维持动物肛温(36.6±0.5)℃，颈部正中切口，分离并结扎左侧颈总动脉、颈外动脉,注意避免刺激迷走神经。从颈总动脉分叉处插入4.0丝线,沿颈内动脉进入距颈总动脉分叉处1.8～2.0cm略感阻力时停止;30min后拔出丝线进行缺血再灌流。术后在约20℃的空调环境下单笼饲养,自由进食、进水。对照组只暴露血管。

　　1.3 针刺方法

　　按照《实验针灸学》[4]，取水沟、内关、曲池、足三里4穴，强刺激手法，交替行针5min。再灌后开始，2次/d。

　　1.4 标本采集和处理

　　再灌48h后断头取脑，各组取6份-8℃冰箱冻存备用做Western?blot和流式细胞仪检测，另外6份常规灌注固定，石蜡包埋，切片做免疫组化检测。

　　1.5 Western?blot检测

　　海马样品制备、蛋白浓度测定、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳以及转移电泳，最后进行化学发光法显影,其过程大致如下:0.1%TTBS洗PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2h，1∶200兔多克隆CDK4一抗(Santa Cruz Biotech, Inc.)4℃孵育过夜;0.1%TTBS洗膜,1∶200稀释的HRP抗兔二抗室温孵育1h,0.1%TTBS洗,15min×4次,最后在暗室中进行化学发光法显影，高敏感胶片摄片、洗片。

　　1.6 免疫组化检测

　　3%H2O2孵育10min，0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)中微波修复(96℃～98℃)10min,冷却至室温。正常血清封闭30min，倾去血清,滴加CDK4兔多克隆抗体，4℃孵育过夜。滴加生物素标记的二抗稀释液，滴加辣根酶标记的链酶卵白素稀释液,室温孵育45min，DAB显色至自来水终止。脱水、透明并封片。常规设立阴性对照。光镜下观察CDK4的表达,以胞浆胞核棕黄色着色的细胞为阳性表达的细胞。

　　1.7 凋亡检测

　　流式细胞计数检测凋亡：大鼠脑海马剪碎后以0.25%胰蛋白酶于37℃消化30min，以等量生理盐水终止消化，经200目筛网过滤,离心,以PBS洗2次,调整细胞数为1×106/ml,双标(PI, Annexin?v)检测凋亡。

　　1.8 统计学处理

　　实验数据采用SPSS9.0统计软件进行分析，组间比较采用t检验，P<0.05为有统计学差异。

　　2 结 果

　　2.1 Western?blot结果

　　Western?blot结果显示出分子量为34KD CDK4蛋白，缺血组CDK4蛋白表达较对照组明显增多(P<0.01)，针刺后CDK4蛋白表达明显减少(P<0.01)。(图1)

2.2 免疫组化结果

　　对照组CDK4蛋白有微弱表达，缺血组CA1、CA2和CA3区有较多CDK4蛋白表达，以CA1区最明显，染色明显加深，针刺后CDK4蛋白表达减少，染色明显减弱。(图2)　图2 大鼠脑缺血再灌注后2d损伤侧海马

　　2.3 流式检测凋亡结果

　　对照组凋亡细胞很少，脑缺血再灌后，细胞凋亡率(0.3758±0.0504)%显著升高(P<0.01)，针刺后细胞凋亡率(0.2289±0.0446)%明显下降(P<0.05)，提示针刺能够抑制凋亡。(图3)

　　3 讨 论

　　周期蛋白依赖性蛋白激酶4(CDK4)是真核细胞有丝分裂的重要亚基之一,它与细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)结合成Cyclin D1?CDK4复合物,正向调节细胞周期,推动细胞周期进展。成体的神经细胞是失去分裂增殖能力的终末分化细胞。最近的研究发现部分CDKs和Cyclins出现在不可能进行增殖分裂的受损害的中枢神经细胞中,尤其Cyclin D1和CDK4倍受关注[5,6],在由NGF撤除或缺氧因素造成的体外培养成年大鼠交感神经细胞和成年兔脊髓神经细胞凋亡研究和脑创伤研究中[7],CDK4及其激活因子Cyclin D1同时在即将凋亡的神经细胞中表达,并且加入CDK4阻滞剂可以明显抑制神经细胞凋亡。Boutillier等[8]认为,细胞凋亡的某些阶段与细胞增生间存在某些相似性,细胞凋亡可能就是异常的有丝分裂。Timsit等[9]认为脑缺血后细胞周期蛋白的表达以其在凋亡机制中的作用为主,而不是在细胞周期中的作用,部分凋亡是由于细胞周期的异常调控所致。总之,细胞周期因子出现在不可能进行增殖分裂的缺血后中枢神经细胞，而不是发挥其在细胞周期中的作用,有可能直接启动了神经细胞的凋亡过程,也有可能与其他因子相互作用而最终导致神经细胞凋亡。

　　脑梗死属中医“中风”范畴，亦称“卒中”。多由风阳暴升与痰火相夹，血气上攻，阴阳失调，痰蒙心窍所致。大量的临床观察和实验研究已经证实，针刺作为脑缺血后促进功能恢复的疗法，对人类及动物模型的脑缺血性损伤具有多方面的保护作用[10,11]。水沟、内关、曲池、足三里4穴为醒脑开窍之穴，联合针刺该4穴对脑缺血再灌注损伤有较好的治疗作用。

　　针刺对脑缺血引起的凋亡有明显的抑制作用，其机制国内外学者做了大量的研究，主要是减少自由基、防止钙超载、下调凋亡基因和上调抑凋亡基因，但在细胞周期调控方面鲜有报道。在本实验中，脑缺血再灌注损伤后CDK4表达升高，神经元凋亡增多，表明CDK4在脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡中发挥作用。针刺能下调CDK4表达，减少凋亡细胞，说明针刺对CDK4的调控作用有可能是针刺抗脑缺血后凋亡的机制之一,针刺有可能对错误的细胞周期信号进行调控从而抑制脑缺血后凋亡的发生。其具体作用机制有待进一步研究。

【】
  　　[1]Butler TL,Kassed CA，Senberg PR,et al.Neurodegeneration in the rat hippocampus and striatum after middle cerebral artery occlusion[J].Brain Res,2002,929(2):252

　　[2]Leverenz JB,Agustin CM,Tsuang D,et al.Clinical and neuropatholgical characteristics of hippocampal sclerosis:a carmntnity?based study[J].Arch Neural,2002,59(7):1099

　　[3]Koizumi J,Yoshida Y,Nakazawa T,et al.Experimental studies of ischemic brain edema: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemia area[J].Jpn J Stroke,1986,8:1

　　[4]林文注,王佩.实验针灸学[M].上海:上海技术出版社,1999：288

　　[5]Sakurai M,Hayashi T,Abe K,et al.Cyclin D1 and Cdk4 protein induction in motor neurons after transient spinal cordis chemia in rabbits[J].Stroke,2000,31:200

　　[6]Park DS,Levine B,Ferrari G,et al.Cyclin dependent kinases inhibitors and dominant negative Cyclin dependent kinase 4 and 6 promote survival of NGF?deprived sympathetic neurons[J].J Neurosci,1997,17:8975

　　[7]Kaya SS，Mahmood A,Li Y，et al.Expression of cell cycle proteins(cyclin D1 and cdk4) after controlled cortical impact in rat brain[J].J Neurotrauma,1999,16:1187

　　[8]Boutillier AL,Kienlen?Campard P,Loeffler JP.Depolarization regulates cyclin D1degradation and neuronal apoptosis:a hypothesis about the role of the ubiquitin/proteasome signalling pat hway[J].Eur J Neurosci,1999,11(3):441

　　[9]Timsit S,Rivera S,Ouaghi P,et al.Increased cyclinD1 in vulnerable neurons in the hippocam? pus after ischaemia and epilepsy:a modulator of in vivoprogrammed cell death?[J].Eur J Neurosci,1999,11(1):263

　　[10]许能贵，马勤耘，许冠荪，等.电针对局灶性脑缺血大鼠脑血流量、脑组织水含量、SOD、 MDA的影响[J].针刺研究，1998,23(3):175

　　[11]陈志强，耿稚萍，张吉，等.电针对脑局部缺血再灌流损伤大鼠自由基的影响[J].针灸，1998,18(7):409