针刺对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡的影响
【摘要】 目的 研究针刺对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡的影响。方法 建立大鼠中动脉阻塞再灌注模型(MCAO)，应用TUNEL法观察神经元凋亡，免疫组织化学法检测Caspase?3蛋白表达。结果 脑缺血再灌注后应用针刺疗法能够降低大鼠神经细胞受损后出现的Caspase?3蛋白表达，并能减轻神经细胞凋亡。结论 针刺疗法能通过有效的抑制脑缺血再灌注后大鼠神经细胞的凋亡起到脑保护作用。
【关键词】 Caspase?3蛋白;针刺;脑缺血再灌注损伤;细胞凋亡
KEY WORDS：Caspase?3 protein;Acupuncture;Cerebral ischenmia?reperfusion injury;Apoptosis
缺血性脑血管病是一种严重危害人体健康的常见病，损伤级联反应是近几年关于该病研究较多的理论之一[1]。本实验应用线栓法制备的大鼠局灶性脑缺血与再灌注模型，通过针刺多个穴位，观察神经细胞凋亡相关蛋白Caspase?3的表达变化，进一步探讨针刺保护脑缺血后神经细胞损伤的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
实验用健康wistar大鼠30只，体质量150～300g，雌雄不拘，由华中理工大学同济医学院实验动物中心提供。采用10%水合氯醛溶液，按 3ml/kg的剂量进行腹腔麻醉后备用。实验动物随机分为3组：对照组、模型组、针刺组，每组各10只。
1.2 动物模型制备
按照[2]采用改良血管内栓线技术制备大鼠局灶性脑缺血与再灌注损伤模型。常规去毛消毒后，颈部正中切开，暴露右侧颈总动脉(CCA)，分离颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，电热烧灼器烧断ECA的分支，结扎并游离ECA主干一段，沿ICA向下分离翼颚动脉，穿线沿起点结扎。在ECA游离段上剪开一小口，插入尖端用火烧圆的4.0单尼龙丝线，轻推尾端使之由ECA通过分叉部进入ICA，由入口长度约18mm，栓塞右大脑中动脉。栓塞30min后拉出尼龙线至ECA结扎端，使血流再灌注，缝合切口。术后动物保温喂养(18℃～20℃)并进行神经体征观察，大鼠有"三偏征"体征，确认模型制作成功。针刺后处死动物并提取脑组织，TUNEL法观察神经元凋亡，免疫组化法观察Caspase?3蛋白表达。
1.3 针刺方法
全部穴位根据针灸学会实验针灸研究会制订的“动物针灸穴位图谱”取穴。针刺组取穴“中脘、天枢、气海、血海、三阴交、丰隆、合谷、太冲、百会”进行针刺，其中“中脘、气海”用提插捻转补泻的补法，“天枢、血海、三阴交”用平补平泻法，“丰隆、百会、合谷、太冲”用提插捻转补泻的泻法，均留针30min，其间每10min行针1次。造模后针刺治疗1次，以后每12h治疗1次，共治疗3次，至24h取材。
1.4 标本制作及组织学评价
实验动物按时断头取脑，脑组织经4%中性多聚甲醛固定2h后，脱水，常规石蜡包埋，自视交叉处向后冠状切片，片厚4μm，每只动物连续切5张。采用TUNEL法(试剂盒购买于Roche公司，货号1684817)对动物脑组织切片进行染色，以神经细胞核染成黄色或棕黄色为阳性。凋亡指数(apoptosis index,AI)是指每张脑组织切片中至少500个细胞中出现的凋亡细胞百分数。采用抗Caspase?3多克隆抗体(试剂盒购买于Neomarkers公司，CPP32,Ab?4)进行免疫组化染色，并用一个评分量化表[3]评价各组Caspase?3的表达程度。评分标准为0(无表达)、1(阳性)、2(强阳性)。
1.5 统计学处理
应用SPSS11.0统计软件对数据进行处理，凋亡指数用(±s)%表示。行方差分析及非参数检验。以P<0.05为有显著性差异。
2. 结 果
2.1 神经细胞的Caspase?3表达
模型组神经细胞Caspase?3表达比对照组明显，P<0.01;而针刺组较模型组Caspase?3表达显著下降，P<0.01。(表1)表 1 wistar大鼠神经细胞Caspase?3表达与对照组比较，*P<0.01;与模型组比较，△P<0.01
2.2 神经细胞凋亡指数的比较
对照组未见神经细胞凋亡，模型组和针刺组神经细胞凋亡指数分别为(79.64±4.53)%和(52.88±9.59)%，与对照组相比模型组神经细胞凋亡明显(P<0.01)，而针刺组神经细胞凋亡与模型组比较明显减轻(P<0.01)。
3 讨 论
细胞凋亡是一种生理条件下的细胞死亡模式，有核细胞在一定条件下通过启动自身内部机制激活内源性核酸内切酶而发生细胞的死亡。目前在研究细胞凋亡过程中最受关注的是线粒体作用、蛋白酶的级联反应(Caspase casecade)和各种死亡基因及其产物的调节作用。其中研究最多的是Caspase蛋白酶在细胞凋亡中的作用。Caspase家族被认为是细胞凋亡不可逆的进入最后实施阶段的关键酶，而分布广泛的Caspase?3是研究较多的Caspase蛋白酶。已经证实，在脊髓损伤的实验模型中，利用特异性的Caspase?3抑制剂能够有效的抑制凋亡[4]。本实验发现，在脑缺血再灌注后应用针刺疗法能够降低大鼠神经细胞受损后出现的Caspase?3表达，并减轻了神经细胞凋亡，起到了脑保护作用。
缺血性卒中在祖国传统医学中被认为是正气不足，痰瘀中阻，多由风阳暴升、痰火相夹、血气上攻、阴阳失调及痰蒙心窍所致，其当以通腑醒神，补气活血为大法[5]。而本实验针刺取穴三组。其中气海合天枢、中脘调畅中焦，通腑理气;气海合血海、三阴交以补气养血活血、通经活络;泻丰隆以祛痰;重刺百会、合谷、太冲以开窍闭、醒神智。诸穴合用，共达启闭开窍、降火豁痰、通经活络、调和阴阳之功效。
本实验结果提示，针刺对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有保护作用，其作用机制可能是降低了神经细胞受损后出现的Caspase?3表达，是否还有其他途径发挥保护作用有待进一步研究。
【】
[1]廖维靖，Frank Wieg，Ulrich Dirnag1.脑缺血损伤的病理生理机制—损伤级联反应[J].国外医学脑血管疾病分册，1998，6(4)：197
[2]Buchan AM，Slivka A，Xue D.The effect of the NM DA receptor antagonist MK?801 on cerebral blood flow and infarct，volume in experimental focai stroke[J].Brain Res，1992，574(2)：17l
[3]Hisanobu T，Ohkuma H，Suzuki S.Effects of thrombin inhibitor on thrombin?related signal transduction and cerebral vasospasm in the rabbit subarachnoid hemorhagemodel[J].Stroke，2003，34(6)：1497
[4]Akin E，Clower B，Tibbs R，et al.Bilirubinproduces apoptosisin cultured bovine brainendothelial cells[J].Brain Res，2002，93l(2)：168
[5]何学斌，吴 耀，舒 荣，等.针刺对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].针刺研究，2003，28(2):85
