组织蛋白酶B及其抑制剂CYSTATIN C与大肠腺瘤及大肠腺癌关系的实验研究

【关键词】  组织蛋白酶B 抑制剂CYSTATIN C 大肠腺瘤 大肠腺癌

　　大肠腺瘤是大肠癌的癌前病变，是大肠癌主要致病因素之一。作者自2003年10月至2004年4月研究组织蛋白酶B（cathepsin B）及其抑制剂cystatin C在大肠腺瘤及大肠腺癌中的表达情况，探讨大肠癌发生、的分子生物学机制。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料 

　　引物由上海捷倍思公司合成，合成的引物序列［1］见表1；RT-PCR盒购自Promega公司； Trizol裂解液购自Invitrogen公司；7例大肠癌组织和7例癌旁正常对照组织均取自手术中切除的组织，正常组织距离癌组织＞10cm；11例大肠腺瘤组织取自大肠镜下切除的息肉。以上新鲜组织用生理盐水迅速清洗，去除表面血液及粪便，立即置入液氮冷却，保存在-80℃冰箱中。手术及内镜下标本均经哈尔滨医科大学附属第二病理科病理医生诊断证实。表1  PCR各引物序列及片段大小（略）

　　1.2  方法 

　　从-80℃冰箱中取出标本，放入研钵中，加入少量液氮，快速研磨成为粉末状，倒入装有1ml Trizol裂解液的1.5ml的Eppendorf管中，混匀，室温下放置10min。每个试管中加入0.2ml氯仿，混匀，室温下放置2～3min。在4℃低温下，12000g 离心15min。离心后，取出试管，将含有RNA的水相约 0.5ml转移到另一个试管中。再加入0.5ml的异丙醇，室温下放置10min。在4℃低温下，12000g 离心10min，在管壁或底部可见无色胶状沉淀。吸去上清，加入1ml 的75%乙醇洗涤RNA 1次。在4℃低温下，以7500 g 离心10min。去掉乙醇，室温下晾干5～10min。将RNA沉淀溶解于20μl无菌高压的去离子水中，-70℃冻存，备用。通过核酸蛋白定量检测仪测定总RNA的浓度并检测RNA质量，用凝胶成像系统观察，拍照。 将2μg的总RNA加入含有以下成分的终体积为 50μl 的一步法RT-PCR反应混合体系进行混合，加入冰上0.2ml的反应管：AMV/Tfl 5X  反应缓冲液10μl；每种10mmol/L的混合d NTP 1μl ；上下游引物各  50pmol；25mmol/L MgSO4  2μl ；5U/μl AMV 反转录酶1μl ；5u/μl Tfl DNA 聚合酶1μl ；RNA 模板2μl；加无RNA酶水至50μl。进行扩增：45℃反转录45 min ，94℃变性 2 min，接着进行30个循环的扩增：95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min ，于4℃贮存。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统进行观察，照相，并运用凝胶分析软件，对PCR产物进行半定量分析。
　
　　1.3  统计学分析 

　　采用SPSS 12.0软件，计量资料以(mean±SD)表示，用单因素ANOVA法，方差不齐用Games-Howell检验进行多个样本均数间的多重比较。

　　2  结果 
  
　　用一步RT-PCR半定量的方法，证实了所有大肠腺癌、腺瘤、正常组织中都存在组织蛋白酶B和抑制剂cystatin C mRNA的表达， 如图1及表2。表2  组织蛋白酶B 和 cystatin C 的mRNA在各组的表达（略）注：腺瘤组、大肠腺癌组、正常组组间两两比较，均P＜0.05

　　3  讨论
        
　　大肠癌的恶性行为主要表现为浸润和转移，此过程需要：肿瘤细胞与细胞外基质和基底膜成分的黏附、细胞对细胞外基质和基底膜的降解、以及细胞移行几个基础过程。组织蛋白酶B可以调节细胞凋亡，促进新生血管形成［2，3］，调节其他蛋白酶的表达。在肿瘤组织中，组织蛋白酶B可以由肿瘤细胞和基质细胞分泌，降解蛋白聚糖，层粘连蛋白，纤维连接蛋白和IV型胶原蛋白等多种细胞外基质成分，破坏黏膜屏障，促进肿瘤细胞一系列降解和移行过程。

　　有研究发现组织蛋白酶B的蛋白表达在大肠癌黏膜中的活性比癌旁正常组织要明显增高［1，4］，但实际上组织蛋白酶B mRNA水平的增加要比活性增加的更多、更稳定，本文实验采用一步RT-PCR的方法测定大肠腺癌、腺瘤、正常组织黏膜中组织蛋白酶B mRNA的表达情况，结果显示组织蛋白酶B mRNA的表达在大肠腺癌，腺瘤，正常对照中呈现逐渐递减的趋势，实验说明组织蛋白酶B的调节机制在mRNA 的基础上已经发生，即组织蛋白酶B表达的调节可能从转录或翻译时就发生了。腺瘤中的组织蛋白酶B明显高于正常组织，这说明过量的组织蛋白酶B的表达参与腺瘤的形成过程，从分子生物学的角度反映出癌前病变腺瘤具有潜在的侵袭性。从腺瘤到腺癌，组织蛋白酶B mRNA的表达又增加了一倍，具有显著性差异，可见腺瘤中的mRNA是癌变的临界点，即(1.06±0.34)。
        
　　从实验结果，作者推测在正常组织中，cystatin C 的适量表达和组织蛋白酶B保持平衡，由于基因突变或失活等多因素的影响，初形成的良性腺瘤刺激了机体的保护反应，导致cystatin C的表达增加从而抑制组织蛋白酶B的表达，控制腺瘤的进一步，如果继续有癌基因或抑癌基因的刺激，良性腺瘤演变成恶性肿瘤，甚至形成肿瘤转移时，此时组织蛋白酶B表达增加，其对细胞外基质的侵蚀作用增强，促进细胞外基质的降解，cystatin C表达明显降低，对组织蛋白酶B的抑制作用减弱，组织蛋白酶B和 cystatin C的表达处于失平衡状态，进一步促进肿瘤的远处转移，两者同时的变化参与大肠癌的演变过程。Janko等［5］测得大肠癌患者血清中cystatin C比正常增加1.6倍，虽然抑制剂的含量增加，但增加的组织蛋白酶B酶活性并未被相应增加的抑制剂平衡，即组织蛋白酶B和抑制剂处于失平衡状态，最终结果是组织蛋白酶B浸润作用依然存在，故有人把组织蛋白酶B与抑制剂的比值作为诊断肿瘤恶性程度的指标［6］。

【】
  　　1 Kyoji Hirai, Munehiro Yokoyama, Goro Asano, et al. Expression of cathepsin B and cystatin C in human colorectal cancer. Human Pathology,1999,30:680-686.

　　2 林晓，王娅兰.大肠癌组织蛋白酶B表达及其与肿瘤微血管密度和生物学行为的关系. 重庆医科大学学报,2002,2:264～270.

　　3 Wang YL, Lin X. Cathepsin B expression and its relationship with microvessel density and biological behavior of colorectal carcinoma. Chinese Journal of Cancer Research,2002,14:293～296.

　　4 Chabowski A, Skrzydlewska E, Sulkowska M, et al. The activity of cathepsin B in colorectal adenocarcinoma. Pol Merkuriusz Lek, 2001,11:330～333 .

　　5 Jan Kos, Marta Krasovec, Nina Cimerman,et al. Cysteine proteinase inhibitors stefin A ,stefin B,and cystatin C in sera from patients with colorectal cancer:relation to prognosis. Clinical Cancer Research,2000,6:505～511.

　　6 Zore I, Krasovec M, Cimerman N,et al. Cathepsin B/cystatin C complex levels in sera from patients with lung and colorectal cancer. Biological Chemistry,2001, 382:805～810.