冠心病痰瘀证候与Ｅ选择素Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多态性的关系研究

            作者：洪永敦，朱会英，陈宇鹏，吴辉，莫鸿辉，黄衍寿，史成军

【摘要】  【目的】从基因多态性角度探讨冠心病痰瘀证的实质。【方法】入选１０７例研究对象（其中正常组２０例，冠心病组８７例），应用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性（ＰＣＲ?ＲＦＬＰ）核苷酸分型技术检测血清E选择素（E?selectin）Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因型，同时采用酶联免疫吸附法测定血清E?selectin浓度。【结果】冠心病痰瘀证组E?selectin Ｇ９８Ｔ的ＧＧ基因型、Ｇ等位基因，E?selectin　Ｓ１２８Ｒ的ＳＲ基因型、Ｒ等位基因频率高于正常组，但经过统计学分析，两者之间差异无显著性意义（Ｐ＞０?０５）。冠心病痰瘀证型组患者血清E?selectin水平高于正常组（Ｐ＜０?０１）。【结论】冠心病痰瘀证可能与Ｅ选择素Ｇ９８Ｔ的Ｇ等位基因、Ｅ选择素Ｓ１２８Ｒ的Ｒ等位基因有一定的相关性。

【关键词】  冠状动脉疾病；痰证；血瘀；E选择素/血液

冠心病是严重影响人类健康生活的疾病之一，炎症在冠心病的形成过程中起着重要作用。遗传流行病学研究显示冠心病的发病有遗传因素的作用，目前相继发现一些基因多态性影响脂质代谢、炎症反应、血栓形成及血管收缩与舒张等病理生理过程，与冠心病发生的危险性增加关系密切。痰瘀证候是冠心病的常见证候。本研究采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性方法（ＰＣＲ?ＲＦＬＰ）检测冠心病痰瘀证候患者的血清Ｅ选择素（E?selectin）Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因型，以期发现其中的内在联系。现将结果报道如下。

    1研究对象

    1?1资料来源研究对象均来源于２００６年２月～２００７年３月在广州中医药大学第一附属心内科临床确诊为冠心病心绞痛和急性心肌梗死的住院病例（部分病例经冠状动脉造影明确诊断）；同时设立正常组作为对照（正常组为健康志愿者）。所有研究对象均为汉族广东省常住人口。

    1?2诊断标准诊断标准参照１９７９年国际心脏病学会及世界卫生组织关于缺血性心脏病的诊断［１］；辨证标准参照中华人民共和国中医药行业标准（１９９４年）《中医病证诊断疗效标准》［２］中的胸痹心痛辨证分型及沈绍功等［３］《中医心病诊断疗效标准与用药规范》。具体中医辨证标准如下：（１）痰浊证组：胸脘闷痛痞满，口黏乏味，纳呆脘胀，苔腻或黄或白滑，脉滑或数。（２）血瘀证组：胸脘刺痛固定，面晦唇青，怔忡不宁，舌质紫暗或见紫斑或舌下脉络紫胀，脉涩或结代。（３）痰瘀证组：胸痛（心前区痛或痛引肩背）或胸脘痞满，舌质紫暗，或有瘀点、瘀斑，舌苔厚腻，脉弦或滑。同时具备以上四大主症者可辨证为痰瘀证。

    1?3一般资料入选研究对象共１０７例，其中正常组２０例，男６例，女１４例，平均年龄为（６４?１５±１２?２２）岁，体质量指数为（２３?７６±２?９１）kg/m2。冠心病组８７例，其中痰瘀证组５５例，男３８例，女１７例，平均年龄为（６４?８７±１２?９１）岁，体质量指数为（２４?６８±３?３３）kg/m2；血瘀证组２０例，男１１例，女９例，平均年龄为（６３?３０±１０?２６）岁，体质量指数为（２４?９４±２?５４）kg/m2；痰浊证组１２例，男８例，女４例，平均年龄为（５４?７５±１１?８６）岁，体质量指数为（２４?１８±２?８０）kg/m2。各组在年龄、性别、体质量指数方面比较差异无显著性意义（Ｐ＞０?０５）,具有可比性。

    2研究方法

    2?1标本收集选择血清／全血作为观察样本，病人入院后次日凌晨６时进行采血，标本放置于冰箱，并于当日对所需血清标本进行以3000r/min离心10min，取上清液，置于-３０℃冰箱保存，全血标本置于-７０℃冰箱保存。

    2?2检测指标及方法E?selectin浓度采用酶联免疫吸附法测定（试剂盒由美国R&D公司提供），由本院实验中心完成；采用聚合酶链反应—限制片段长度多态性（ＰＣＲ?ＲＦＬＰ）基因分析法检测E?selectin　Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因型，由中山大学组织配型中心完成。血清E?selectin酶联免疫法测定具体操作方法：（１）血清标本置于室温下解冻；（２）按说明准备试剂、标准品及样本；（３）每孔加入100μL测定稀释液；（４）每孔加入１００μL标准品或已稀释的样本。室温下在振荡机上以（５００±５０）r/min进行振荡，孵育1?5h；（５）抽吸清洗６次，将微孔在吸水纸上扣干；（６）每孔加入１００μL酶联物，室温下振荡孵育３０min；（７）每孔加入１００μL显色液，室温避光孵育1h；（８）每孔加入５０μL终止液，３０min内在４５0nm处读Ｄ值；（９）以Ｄ值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据血清样品的Ｄ值可在标准曲线上查出其浓度。Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多态性的关系研究E?selectin　Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因型检测的ＰＣＲ?ＲＦＬＰ基因分析法：（１）使用试剂：ＤＮＡ分子标准ＤＬ２０００　Marker（大连宝生物公司）、QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen公司产品）、Taq DNA Polymerase（北京索奥公司产品）、DNTPs（北京索奥公司产品）、HphI限制性内切酶（NEB公司产品）、PstI限制性内切酶（TAKARA公司产品）;（２）外周血白细胞ＤＮＡ的提取（操作方法按照试剂的说明书进行）：全部受试者均取外周静脉血2mL，ＥＤＴＡ抗凝，采用Qiagen DNA抽提试剂盒提取基因组ＤＮＡ，步骤如下：①取１?５mL离心管，注明名字及编号；②管底加ProteaseK 20μL，全血２００μL，Buffer AL 200μL，混匀后５６℃水浴１０min;③取无水乙醇２００μL加入管中，混匀，转移入Spin Column,8000r/min离心５min;④弃滤液，Spin Column转移入清洁收集管中，加ＡＷ１液５００μL，8000r/min离心５min；⑤弃滤液，Spin Column转移入另一清洁管中，加ＡＷ２液５００μL，8000r/min离心５min；⑥弃滤液，Spin Column转移入已标名字的１?５mL离心管中，加Buffer AE或蒸馏水２００μL，8000r/min离心５min；-２０℃保存备用。（３）聚合酶链反应：①引物序列：引物序列［９］并结合Primer Express? Software 2?0版设计，引物序列见表１，全部引物由Invitrogen 公司合成。②反应体系：１０倍PCR Buffer ５μL、１０mmoldNTPs１μL、上下游引物各１０pmol、Taq酶３Ｕ、膜板５μL、加无菌去离子水至５０μL。③反应条件：９３℃３min预变性，９３℃３0s，各外显子参照上述退火温度，共３５个循环，７2℃延伸１０min。反应后检测，取８μLＰＣＲ扩增产物用２0g/L的琼脂糖凝胶进行电泳，ＰＣＲ产物在２0g/L琼脂糖中电泳检测后-２０℃保存备用。④结果：ＰＣＲ产物经２0g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，片段大小符合预先设计。（４）ＰＣＲ限制性片段长度多态性分析（ＰＣＲ?ＲＦＬＰ）：①HphI反应体系：PCR 反应混合物 10μL(约1μg of DNA)，10倍NEB Buffer2μL，HphI 1μL，加水、无核酸酶试剂至20μL，温和震荡，短暂离心数秒。３７℃酶切过夜。取10μL酶切产物用２0g/L琼脂糖凝胶进行电泳；②PstI反应体系：PCR 反应混合物 10μL(约 1μgof DNA)，１０倍H Buffer ２μL，PstI 1μL，加水、无核酸酶试剂至２０μL，温和震荡，短暂离心数秒。３７℃酶切4h。取10μL酶切产物用２0g/L琼脂糖凝胶进行电泳。

    表1PCR引物序列

    Table 1PCR primer sequence基因PCR 引物(5?→3?)退火温度(℃)长度(bp)G98TTGCCCAAAATCTTAGGATGCAAGCCCAGGGAAGAACACAT59332S128RAGTAATAGTCCTCCTCATCATGACCATCTCAAGTGAAGAAAGA55186

    2?３统计学方法采用ＳＰＳＳ　１１?５软件包进行分析。分类资料的组间比较采用χ2检验。计量资料采用±s表示，两组以上均数的组间比较采用One way ANOVA检验，用Bonferroni方法进行两两比较。基因型和等位基因频率采用直接计数法统计，研究对象与Hardy?Weinberg平衡的符合程度，基因型和等位基因频率的组间比较采用χ2检验。

    3结果

    ３?１各组E?selectin水平比较表２结果显示，冠心病各证型组患者血清E?selectin水平均高于正常组（Ｐ＜０?０１），但各证型组间比较，差异无显著性意义（Ｐ＞０?０５）。 表2各组E?selectin水平比较①Ｐ＜０?０１，与正常组比较３?2各组E?selectin G98T及Ｓ１２８Ｒ基因型比较将符合纳入标准且资料完备的８２例应用ＰＣＲ?ＲＦＬＰ测定基因型，其中正常组１６例，痰瘀组４５例，血瘀组１３例，痰浊组８例，因血瘀组和痰浊组检测例数较少，故将其合并（２１例）为非痰瘀组（以与痰瘀互结证候的痰瘀组区别），再进行统计分析。

    ３?２?1E?selectin的Ｇ９８Ｔ酶切结果见图１。

    3?2?2E?selectin的S128R酶切结果见图2。

    3?2?3各组E?selectin的G98T基因型和等位基因的频率分布表3结果显示，冠心病痰瘀组GG基因型、G等位基因频率高于正常组，GT基因型、T等位基因频率低于正常组，并符合Hardy?Weinberg平衡，但两者之间差异无显著性意义（Ｐ＞０?０５）。各组之间的基因型分布、等位基因频率比较差异无显著性意义（Ｐ＞０?０５）。HphI酶切（GG:194/138,GT:332/194/138,TT:332);

    1、2为GT基因型，3、4、5、6、7为GG基因型，8为

    PCR产物，未见TT型图1E?selectin G98T酶切结果

    Figure 1Digestion of E?selectin G98T with enzyme

    PstI酶（SS:123/63,SR:186/123/63,RR:186);

    1为PCR产物，2、3、5、7为SS基因型，4、6为

    SR基因型，N为阴性对照，未见RR基因型图2E?selectin S128R酶切结果

    Figure 2Digestion of E?selectin S128R with enzyme表3各组E?selectin的Ｇ９８Ｔ基因型和等位基因的频率分布

    Table 3The frequency of genotype and

    allele of E?selectin G98T（±s）Ｎ(p/%)

    组别Ｎ基因型ＧＧＧＴ等位基因ＧＴ正常组1611（68?8）5（31?2）27（84?4）5（15?6）痰瘀组４５３９（８６?７）６（１３?３）８４（９３?３）６（６?７）非痰瘀组２１１９（９０?５）２（９?５）４０（９５?２）２（４?８）

    3?2?4各组E?selectin的S128R基因型和等位基因的频率分布表４结果显示，冠心病痰瘀组ＳＲ基因型、Ｒ等位基因频率高于正常组，ＳＳ基因型、Ｓ等位基因频率低于正常组，并符合Hardy?Weinberg平衡，但两者之间差异无显著性意义（Ｐ＞０?０５）。各组之间的基因型分布、等位基因频率比较差异无显著性意义（Ｐ＞０?０５）。表４各组E?selectin的Ｓ１２８Ｒ基因型和等位基因的频率分布

    ４讨论

　　冠心病属中医胸痹心痛范畴，主要病机为痰瘀互结，心脉痹阻，其病位在心脉，发病多与肝、脾、肾三脏功能失调有关，如肾虚、肝郁、脾失健运等，病理变化主要表现为本虚标实，虚实夹杂，以痰瘀痹阻为标实的特点。曹洪欣等［４］研究认为冠心病的病机为本虚标实，本虚以心阳虚为主；标实除血瘀、痰浊、气滞外，痰瘀互结与冠心病直接相关。痰瘀互结证是冠心病的常见证候，痰瘀互结是冠心病发病的重要病理因素，痰瘀同治法是冠心病的常用法则。本课题组的临床研究共收集冠心病９４例，其中痰瘀证占５８?５％，是冠心病的主要证型，这与报道的资料相符合［５］。冠心病是一种多因素、多基因遗传疾病，且与环境因素密切相关；遗传因素在冠心病人群中可能起着不可忽视的重要作用。近年来，越来越多的证据表明，炎症在冠心病的发生、和预后过程中起着重要的作用。炎症反应的激活可能是引起斑块不稳定而导致急性冠脉综合征的主要因素。E?selectin参与多种白细胞（包括粒细胞、巨噬细胞、单核细胞等）以ＣＤ４记忆性Ｔ细胞亚群的黏附与聚集，它在免疫、炎症及动脉粥样硬化的形成过程中起着重要作用［６-７］。杨立森等［８］的研究表明，冠心病患者血清E?selectin水平增高，反映了病情的严重程度，可作为可疑胸痛患者的辅助鉴别诊断手段。有研究证实E?selectin基因第２和第４外显子分别存在Ｇ／Ｔ和Ｓ／Ｒ多态性，这两种多态性可能影响E?selectin基因表达和功能，并可能与心血管疾病，尤其是与冠心病发病有密切关系［９-１０］。文献报道，在人粥样硬化斑块处，E?selectin的表达增加［１１］，冠心病患者血清可溶性E?selectin也有不同程度的升高［１２］。通常认为E?selectin水平的变化反映了细胞表面成分的翻转和蛋白质的水解，可作为疾病活动的标志。林帆等［１３］研究显示了E?selectin Ｓ１２８Ｒ多态性与冠心病的发生有关，Ｒ等位基因可能是冠心病的危险因素。李艳等［１４］研究表明E?selectin　Ｓ１２８Ｒ基因多态性与冠心病的发病有关联，并可影响血清E?selectin水平，Ｒ等位基因可能是冠心病发病的遗传易感基因；E?selectin基因Ｇ９８Ｔ多态性在冠心病发病中可能不起直接作用。E?selectin　Ｓ１２８Ｒ经ＰＣＲ扩增产物片段大小为１８６bp，根据限制性内切酶PstI酶切片段的情况，基因型有3种：ＳＳ型（１２３、６３bp两条带），ＳＲ型（１８６、１２３、６３bp三条带），ＲＲ型（１８６bp一条带）。本研究结果显示，E?selectin　Ｓ１２８Ｒ的基因型为ＳＲ基因型、ＳＳ基因型，未发现ＲＲ基因型。其中正常组ＳＳ基因型携带者占８７?５％，ＳＲ基因型携带者占１２?５％，Ｓ等位基因频率为９３?７５％，Ｒ等位基因频率为６?２５％；冠心病痰瘀组ＳＳ基因型携带者占８２?２％，ＳＲ基因型携带者占１７?８％，Ｓ等位基因频率为９１?１％，Ｒ等位基因频率为８?９％。冠心病痰瘀组E?selectin　Ｓ１２８Ｒ的ＳＲ基因型、Ｒ等位基因频率高于正常组，并符合Hardy?Weinberg平衡，但两者之间差异无显著性意义（Ｐ＞０?０５）。E?selectin　Ｇ９８Ｔ经ＰＣＲ扩增产物片段大小为３３２bp，根据限制性内切酶HphI酶切片段的情况，基因型为ＧＧ型（１９４、１３8bp两条带），ＧＴ型（３３２、１９４、１３８bp三条带），ＴＴ型（３３２bp一条带）。本研究结果显示，E?selectin　Ｇ９８Ｔ的基因型为ＧＧ基因型、ＧＴ基因型，未发现ＴＴ基因型。其中正常组ＧＧ基因型携带者占６８?８％，ＧＴ基因型携带者占３１?２％，Ｇ等位基因频率为８４?４％，Ｔ等位基因频率为１５?６％；冠心病痰瘀组ＧＧ基因型携带者占８６?７％，ＧＴ基因型携带者占１３?３％，Ｇ等位基因频率为９３?３％，Ｔ等位基因频率为６?７％。冠心病痰瘀组E?selectin　Ｇ９８Ｔ的ＧＧ基因型、Ｇ等位基因频率高于正常组，并符合Hardy?Weinberg平衡，但两者之间差异无显著性意义（Ｐ＞０?０５）。目前，关于冠心病与E?selectin　Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多态性的研究报道不少，但尚未能形成统一的意见，这可能与冠心病为多基因遗传疾病存在一定的关联，不同基因的多态性在冠心病的发病过程可能有着直接或间接的联系。然而，关于冠心病中医证型与E?selectin Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多态性的研究报道尚未发现。本研究初步探讨了冠心病痰瘀证与E?selectin　Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多态性的关系，推测冠心病痰瘀证可能与E?selectin　Ｇ９８Ｔ的Ｇ等位基因及E?selectin　Ｓ１２８Ｒ的Ｒ等位基因有关。因本研究样本量少，未得出统计学差异，但这将为冠心病痰瘀证的研究提供了新的思路。

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