何首乌蛋白质和蒽醌苷对D半乳糖衰老小鼠学习记忆及代谢产物的影响

【摘要】  　　【目的】观察何首乌蛋白质和蒽醌苷对D?半乳糖所致衰老小鼠学习记忆与相关酶及代谢产物的影响。【方法】选用昆明种小鼠80只，随机分为8组：正常组，模型组，维生素E（VE）组（剂量为90mg·kg-1·d-1），何首乌蛋白质（PRPM）高、低剂量组（剂量分别为20、5mg·kg-1·d-1），何首乌蒽醌苷（AGRPM）高、低剂量组（剂量分别为28、7mg·kg-1·d-1），AGRPM与PRPM混合组（混合组，均取两者低剂量）；除正常组外，其他组均采用长期（7周）皮下注射D?半乳糖复制衰老小鼠模型。采用三等分辐射式迷宫测试小鼠的学习速率，用一次性被动回避反应测试小鼠的记忆能力；采用紫外可见分光光度计测定小鼠脑组织超氧化物歧化酶（SOD）和单胺氧化酶（MAO）的活力及脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量；采用荧光分光光度计测定肝组织中脂褐素（LF）的含量。【结果】高剂量PRPM组能显著改善衰老小鼠的记忆能力（P＜0?05），高剂量AGRPM组可显著改善衰老小鼠的学习速率和记忆能力（P＜0?05或P＜0?01）；PRPM组和AGRPM组均能显著增加衰老小鼠的肝系数、胸腺系数、脑系数和脾系数（P＜0?05或P＜0?01），降低衰老小鼠脑组织MAO的活力、脂质过氧化产物MDA的含量及肝组织中LF的含量（均P＜0?05或P＜0?01）；PRPM、AGRPM低剂量组及混合组均能显著增加衰老小鼠脑组织SOD的活力（P＜0?05或P＜0?01）。【结论】何首乌蛋白质和蒽醌苷具有一定的抗衰老及促进记忆能力的作用。

【关键词】  何首乌/药；衰老/中药疗法；何首乌/分离与提纯；疾病模型，动物；小鼠

　　Abstract: ObjectiveTo observe the effects of protein and anthraquinones glycosides from Radix Polygoni Multiflori (RPM) on learning and memory as well as associated enzymes and metabolites in mice with D?galactose?induced aging. Methods Eighty Kunming mice were equally randomized into 8 groups: normal group, model group, vitamin E (90mg·kg-1·d-1) group, high?and low?dose RPM protein (20 and5 mg·kg-1·d-1 respectively) groups, high? and low?dose RPM anthraquinone glycoside (28 and 7mg·kg-1·d-1 respectively) groups, combination (low?dose RPM protein and low?dose RPM anthraquinone glycosides)group. Except the normal group,the mice in other groups received subcutaneous injection of D?galactose to indue the aging model.The learning rate of mice was detected with trisection radiation maze, memory was evaluated by one?time passive avoidance response, cerebral superoxide dismustase (SOD) and monoamine oxidase (MAO) activities as well as malondialdehyde（MDA）content were detected with ultraviolet spectrophotometer, and hepatic lipofuscin (LF) content was examined with fluorescence spectrophotometer. Results Memory of aged mice was much improved in high?dose RPM protein group (P＜0?05), and learning rate and memory were improved in high?dose RPM anthraquinone glycosides group (P＜0?05 or P＜0?01). RPM protein and anthraquinone glycosides increased liver index, thymus index, brain index and spleen index of aged mice (P＜0?05 or P＜0?01), and decreased cerebral MAO activity, MDA content and hepatic LF content (P＜0?05 or P＜0?01). Cerebral SOD activity was increased in low?dose RPM protein group, low?dose RPM anthraquinone glycosides group and the combination group (P＜0?05 or P＜0?01). ConclusionRPM protein and anthraquinone glycosides show certain effect on counteracting aging and promoting memory of D?galactose?induced aging rats.

　　Key words:RADIX POLYGONI MULTIFLORI/pharmacology;AGING/TCD therapy;
RADIX POLYGONI MULTIFLORI/isolation & purification;DISEASE MODELS, ANIMAL;MICE

　　何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，为传统的抗衰老药物之一，可补肝肾、益经血，在多种抗衰老中药制剂中为主药［1］。但关于何首乌蛋白质及其重要成分蒽醌苷的抗衰老作用尚未见报道。本实验以道地产区广东德庆的何首乌为材料，探讨其蛋白质（干粉含量23?6g/kg）及蒽醌苷对D?半乳糖衰老小鼠学习记忆及代谢产物的影响，现将结果报道如下。

　　1 材料与方法

　　1?1动物

　　SPF昆明种小鼠，雌性，体质量（20±2）g，广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：STXK（粤）2005?0001。

　　1?2药物与试剂

　　何首乌为广东德庆产蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，由广东药学院药用植物教研室鉴定。何首乌蛋白质（protein from Radix Polygoni Multiflori，PRPM）：脱脂何首乌粉，用缓冲液（NaH2PO4/NaOH,0?05mol/L，pH8?0）4℃提取，硫酸铵分级沉淀，离心（10 000r/min×21min,7℃）收集40%~70%硫酸铵饱和度所沉淀的蛋白质，用双蒸水透析48h(平均每隔6h换水1次)，离心（条件同前），上清液过Sephadex G 75柱，用双蒸水洗脱，收集280nm有吸收峰的洗脱液，冷冻干燥，备用（蛋白质含量为824g/kg）；何首乌蒽醌苷（anthraquinone glycosides from Radix Polygoni Multiflori,AGRPM）：用体积分数90%的热乙醇提取总蒽醌，再用氯仿萃取游离蒽醌，利用蒽醌苷与Pb2+形成的络合物在一定pH下能沉淀析出而加以分离，通H2S脱铅，重结晶，备用（蒽醌苷的含量为932g/kg）;丙二醛（MDA）试剂盒（批号：20041108）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号：20041111）、单胺氧化酶（MAO）试剂盒（批号：20041115）、脂褐素（LF）试剂盒（批号：20041115）均为南京建成生物工程研究所产品；维生素E（VE）胶丸（广州星群药业股份有限公司，批号：BE50012）；D?半乳糖（广州威佳科技有限公司，批号：2614B19）。

　　1?3仪器

　　MG?2型三等分辐射式迷宫（江苏省沙洲县三兴声电公司）；一次性被动回避反应箱（广州华南师范大学）。

　　1?4分组与给药

　　将80只小鼠随机分为8组：正常组，模型组，VE组（剂量为90mg·kg-1·d-1）,PRPM高、低剂量组（剂量分别为20、5mg·kg-1·d-1），AGRPM高、低剂量组（剂量分别为28、7mg·kg-1·d-1），PRPM和AGRPM混合组（混合组，其中PRPM剂量为5mg·kg-1·d-1，AGRPM剂量为7mg·kg-1·d-1)，每组各10只。正常组小鼠每天皮下注射（sc）生理盐水0?5mL,其他组小鼠每天sc50mg/L D?半乳糖生理盐水0?5mL。同时，每天分别给各组小鼠灌胃上述药物1次（正常组及模型组灌胃0?5mL生理盐水），连续7周。

　　1?5观察指标与检测方法

　　1?5?1学习速率以及记忆能力测试

　　实验结束后2d，采用三等分辐射式迷宫测试小鼠的学习速率（以第1天与第2天正确反应率为观察指标），用一次性被动回避反应箱测试小鼠的记忆能力（以步入洞内所需时间即潜伏期）。

　　1?5?2相关酶及代谢产物检测

　　测试学习速率以及记忆能力完成后，处死小鼠，称体质量及肝、胸腺、脾脏、脑质量，计算脏器系数（w）。然后分别取脑和肝组织，以1g组织加入9mL生理盐水的比例制成匀浆样品。取脑匀浆样品，按试剂盒方法，采用紫外可见分光光度计测定小鼠脑组织SOD、MDA和MAO的含量；取肝匀浆样品，按试剂盒方法用荧光分光光度计测定肝组织中的LF含量。

　　2结果

　　2?1各组对衰老小鼠体征的影响与正常组比较，模型组小鼠毛发枯黄无光、呆滞嗜睡，饮食量较少，体形消瘦，大便干而少，与衰老小鼠特征相符。与模型组比较，各组小鼠毛发均白皙光滑，大便较软，其中AGRPM高、低剂量组及混合组小鼠的饮食量较大；PRPM高、低剂量组以及混合组小鼠的大便量较多，脾性较急躁。

　　2?2各组对衰老小鼠学习速率及记忆能力的影响

　　表1结果显示，模型组第1天与第2天正确反应率均显著低于正常组（P＜0?05），VE组能显著提高衰老小鼠的正确反应率（P＜0?05）;AGRPM高、低剂量组及混合组均能显著提高衰老小鼠正确反应率（P＜0?05），但PRPM高、低剂量组衰老小鼠正确反应率无显著性增加（P＞0?05）。模型组小鼠步入洞内所需时间（潜伏期）显著减少（P＜0?05），VE组能使潜伏期显著延长（P＜0?05），PRPM高剂量组、AGRPM高剂量组及混合组潜伏期均显著延长（P＜0?05或P＜0?01）。表1PRPM和AGRPM对D?半乳糖衰老小鼠学习速率及记忆能力的影响（略）

　　2?3各组对衰老小鼠脏器系数的影响

　　表2结果显示，与正常组比较，模型组小鼠的肝、脑、脾及胸腺系数均显著减少（P＜0?05或P＜0?01），表明衰老小鼠的肝、脑以及免疫脏器出现萎缩。除VE及PRPM低剂量对脾脏系数无显著性影响（P＞0?05）外，其他各给药组均能显著增加模型小鼠的肝、脑、脾及胸腺系数（P＜0?05或P＜0?01）。表2PRPM、AGRPM对D?半乳糖衰老小鼠脏器系数的影响（略）

　　2?4各组对衰老小鼠脑组织SOD、MAO、MDA及肝组织LF含量的影响

　　表3结果显示，与正常组比较，模型组小鼠脑组织的SOD活性显著减少，MAO活性显著增加，脑组织MDA含量和肝组织LF含量均显著增加（P＜0?05或P＜0?01）。VE可显著增加衰老小鼠脑组织的SOD活性，并显著减少衰老小鼠脑组织的MAO活性和MDA含量，显著降低衰老小鼠肝组织LF含量（均P＜0?01）。PRPM低剂量组、AGRPM低剂量组及混合组能显著增加衰老小鼠SOD活性（P＜0?05或P＜0?01）；除混合组MAO活性外，各给药组均能显著降低衰老小鼠脑组织中MAO的活性及MDA含量和肝组织中LF含量（P＜0?05或P＜0?01）。表3PRPM、AGRPM对D?半乳糖衰老小鼠脑组织SOD、MAO、MDA及肝组织LF含量的影响（略）

　　3讨论

　　小鼠长期注射D?半乳糖后，毛发枯黄无光，行动迟缓，学习记忆能力下降，脏器系数减少，脑组织中SOD活性减少而MAO活性、MDA含量和肝组织中LF含量增加。维生素E能显著改善上述指标，表明本试验所建立的衰老模型是成功的。何首乌蛋白质和蒽醌苷能改善衰老小鼠的外观体征及学习记忆能力，增加脏器系数，使脑组织的SOD活性增加，MAO活性及MDA含量减少，肝组织中的LF含量减少，表明何首乌蛋白质和蒽醌苷具有一定抗衰老作用。口服给药适合于抗衰老的长期用药。本试验经口灌胃何首乌蛋白质后，其不仅消化分解成游离氨基酸，同时还释放出大量的短肽链，这些短肽链吸收入血后可能发挥了抗衰老作用［2］。研究表明［3］，高脂血症动物或病人血清中的过氧化脂质含量与其胆固醇、甘油三酯的含量正相关，何首乌蒽醌苷的抗衰老作用可能与其降血脂作用有关。报道［1，4-8］：何首乌的水煎剂、水提醇沉物、醚及乙酸乙酯提取物、多糖、二苯乙烯苷等均有抗衰老作用。何首乌（广东德庆产）干燥粉末中蛋白质的含量达23?6g/kg，蒽醌苷是何首乌中的重要成分之一［9］，因此研究它们的抗衰老作用可以为全面揭示其抗衰老有效成分提供。有待进一步研究的工作是：将何首乌的蛋白质和蒽醌苷进行进一步的分离纯化，探讨其单一成分的抗衰老作用，对具有抗衰老作用而毒副作用较大的化合物经过衍生改造，最终获得作用确切、毒副作用较小的抗衰老新药。

【参考文献】
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　　［2］Yu JH,Lai XX?The physiological activity and application of antihypertensive peptides derived from food proteins［J］.China Food Additives,2000(2):11.

　　［3］Liu JZ,Lin X,Li XE.Effect of protein and anthraquinone glucosides from Semen Cassia on learning and memory capacity and related substances of senile induced by D?galactose［J］.China J Chin Mater Med,2007,32(6):516.

　　［4］Huang LY.Effect of Trillium tschonoskii Maxim and Radix polygonum multiflorum on expression function of the antioxidation enzyme of dementia mice induced by haloperidol［J］.Zhejiang J Tradit Chin Med,2006,41(7):430.

　　［5］Qiu G,Wu XQ.Effect of Polygonum multiflorum Thunb?on BDNF expression in rat hippocampus induced by amyloid beta?protein(Aβ)1-40［J］.J Cen South Univ(Med Sci),2006,31(2):194.

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　　［7］Yang XY.The effects of refined Polygonum multiflorum Thunb.polysaccharide on learning memory and the activities of enzymes in the brain for the experimental mice with dementia［J］.Prog Pharm Sci,2005,29(12):557.

　　［8］Liu L,Zhao L,Li YL,et al.Protective effect of 2?3?5?4′?tetrahydroxystilbene?2?β?O?D?glucoside on hippocampal neurons in dementia rats induced by chronic cerebral ischemia［J］.Chin Pharm J,2006,41(5):354.

　　［9］Luo RZ,Jia W,Zhao LB,et al.General review on Radix polygonum multiflorum［J］.Chin Tradit Herb Drugs,2005,36(7):1097.