组胺HR1拮抗剂对变应性鼻炎IL?12及DCs的影响

                 作者：燕志强，章如新，余少卿，温武，吴革

【摘要】  目的： 通过观察组胺HR1拮抗剂干预后对变应性鼻炎（AR）大鼠血清中IL?12，以及鼻黏膜中树突状细胞（DCs）的变化和影响, 并探讨其作用机制. 方法： 实验大鼠随机分为正常对照组，AR无干预组，AR HR1拮抗剂干预组，观察致敏以及组胺HR1拮抗剂干预后大鼠血清IL?12含量及鼻黏膜中DCs数量的变化. 结果： 与正常对照组相比，AR无干预组血清IL?12含量下降(P<0.01)，鼻黏膜中DCs数量则增加（P<0.01）；而AR HR1拮抗剂干预组经组胺HR1拮抗剂干预后，血清IL?12含量回升(P=0.042)，鼻黏膜中DCs数量则下降（P=0.003）. 结论： AR时IL?12含量减少以及DCs数量增加是AR发病的重要因素；组胺HR1拮抗剂可以抑制IL?12，DCs的变化，是其在AR中发挥作用的机制之一.

【关键词】  鼻炎，变应性，常年性；白细胞介素?12；树突状细胞；组胺；受体；拮抗剂

    0引言

    组胺是变应性鼻炎（allergic rhinitis, AR）中主要的炎性介质. 随着分子生物学技术的，组胺及其受体系统功能在AR等变态反应性疾病中的作用尤其对免疫系统的影响逐步引起重视. 组胺HR1拮抗剂是目前AR的主要一线治疗药物之一，对于控制AR的速发症状有良好的作用. 我们通过建立AR动物模型，并在给予组胺HR1拮抗剂干预后，观察大鼠血清IL?12及鼻黏膜中树突状细胞（DCs）水平的变化，以探讨组胺HR1拮抗剂在AR中的作用机制，旨在为新的治疗策略提供理论依据.

    1材料和方法

    1.1材料6 wk龄健康SD大鼠36只，雌雄各半，体质量160～200 g(第二军医大学长海动物实验中心). 静养1 wk后，按体质量随机分为正常对照组（NC组），AR无干预组（AR组）和AR H1拮抗剂干预组（HA组）. 所有动物实验操作均依照第二军医大学试验动物伦理委员会所规定的程序进行. S?100一抗工作液（武汉博士德生物工程公司）；S?100二抗试剂（即用型，Dako公司）.

    1.2方法

    1.2.1模型制备及药物干预AR组和HA组大鼠参照［1］的方法制作动物模型. NC组用生理盐水代替卵蛋白同步进行作为对照，10 g/L的卵蛋白生理盐水溶液鼻腔激发5 d，AR组和HA组动物均出现典型AR症状后，自第6日起，AR组继续10 g/L鸡卵蛋白溶液鼻腔激发，HA组则在10 g/L的卵蛋白溶液鼻腔激发前30 min给予氯雷他定混悬液灌胃（10 mg/kg），1次/d，累计9 d. 在鼻腔激发第14日鼻腔激发后1 h，开始收集标本，于最后1次激发后1 h，戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉（40 mg/kg），麻醉成功后采集实验用标本. 采血离心后取上清夜-20℃保存，然后取鼻黏膜一部分中性甲醛固定制备石蜡切片, 取部分切片HE染色常规病检查.

    1.2.2标本检测

    1.2.2.1S?100标记DCs细胞取中性甲醛固定的鼻黏膜,经脱水、透明、浸蜡、包埋后切片（片厚4 μm），然后烤片、脱蜡至水；PBS溶液洗涤（3 min×3）,用3 mL/L H2O2封闭内源性过氧化物酶（室温20 min）；PBS溶液洗涤（3 min×3）,加适量0.01 mol/L(pH6.0) CBS溶液, 微波抗原修复（Ⅲ档，10 min×2）；顺序加S?100一抗工作液1∶50，37℃，2 h；S?100二抗工作液，37℃，30 min，PBS溶液洗涤（3 min×3）；最后行DAB显色（10 min）及苏木素复染,风干后中性树脂封片、烤片. S?100免疫组化方法对DCs进行定位及相对定量研究,光学显微镜下记数5个高倍视野下平均每个高倍视野下S?100阳性DCs细胞数.

    1.2.2.2ABC?ELISA法测定血清中IL?12含量将标准样品稀释液或待测样品100 μL依次加入微孔板孔中，其中前7孔为梯度稀释的样品稀释液，第8孔为空白对照，37℃放置120 min；洗涤液将反应板充分洗涤4次后,每孔中加入一抗体工作液100 μL,充分混匀后37℃静置60 min；再次用洗涤液充分洗涤反应板,反复4次；然后每孔加酶标抗体工作液100 μL，37℃静置60 min；同前洗涤反应板,每孔加底物工作液100 μL，37℃暗处反应5～10 min,出现黄色；每孔加1滴反应终止液混匀，颜色加深,492 nm处读取A值. 根据标准品稀释液测定结果并绘制标准曲线，根据标准曲线得出待测样品IL?12浓度.

    统计学处理：采用SPSS11.0软件包进行统计学处理. 数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析及LSD?t检验. P<0.05为差异具有统计学意义.

    2结果

    2.1大鼠鼻黏膜组织病改变结果显示，AR组大鼠鼻黏膜组织水肿，上皮内杯状细胞增多，黏膜固有层动、静脉及毛细血管不同程度地扩张，间质内有较多嗜酸性粒细胞浸润，并有较多淋巴细胞等炎症细胞出现；正常对照组没有变化，经组胺HR1拮抗剂处理后炎症程度较AR组明显减轻(图1).

    2.2鼻黏膜S?100阳性树突状细胞变化在正常对照组大鼠的鼻黏膜中存在S?100免疫活性DCs，与AR组大鼠鼻黏膜中S?100免疫活性DCs数量相比较有所增加（P<0.01），经组胺HR1抗拮抗剂干预后，S?100免疫活性DCs数有所减少（P=0.003，表1，图2）.表1各组大鼠鼻黏膜S?100阳性DCs细胞数，血清IL?12含量结果比较

    2.3三组大鼠血清IL?12含量测定与正常对照组大鼠相比较，AR组大鼠血清IL?12含量有所减少(P<0.01)，而经氯雷他定处理后IL?12水平较AR组增高(P=0.042，表1).

    3讨论

    DCs是体内最重要、功能最强的抗原递呈细胞,处于启动特异免疫反应的中心地位,是机体内目前所知的唯一能激活初始型T细胞产生特异性免疫应答的APC而倍受关注. DCs在AR等变态反应性疾病中的作用日益受到重视，其可以影响Th0细胞分化从而影响Th1/Th2反应的平衡状态，其中DCs所分泌的细胞因子IL?12在这一过程个发挥着作用［2］. 研究［3］发现DCs经常位于组胺来源附近，如结缔组织中的肥大细胞，表明组胺可以通过影响DCs生长、发育、分化及细胞因子的表达而影响Th1/Th2的平衡状态.

    研究［4-5］发现，各种不同类型的DCs表面均具有组胺的四种HR，但表达量有所不同，这为组胺影响DCs的功能奠定了基础. 我们通过制备AR大鼠模型，分别以组胺、氯雷他定作为激动剂和拮抗剂观察AR中组胺对DCs表达以及细胞因子IL?12产生的影响. 实验中我们通过S?100免疫组化方法对DCs进行定位及相对定量研究，结果显示正常大鼠鼻黏膜组织中存在一定数量的DCs.

    DCs被认为是IL?12的主要细胞来源，尽管AR中DCs数量有显著增加，但IL?12的产生不但没有增加反而有所下降，说明DCs产生IL?12的能力受到抑制，组胺在这一作用中可能起到至关重要的作用. IL?12产生的匮乏导致Th0分化不平衡，Th1细胞和Th1细胞因子生成减少，从而使Th2细胞和Th2细胞因子反应增强. HR1拮抗剂氯雷他定干预后，我们观察到IL?12含量有显著差异的改变，表明HR1拮抗剂可以影响AR模型动物中IL?12及DCs的表达，提示组胺可以影响DCs产生IL?12的能力的影响,并且是通过HR1介导这种作用，但也不排除通过其它受体亚型发挥作用的可能性. 有体外实验也表明组胺可以通过HR1/HR2抑制DCs产生IL?12，但也有报道选择性的激动或抑制HR1不影响IL?12的产生［3，6］. 我们的结果提示组胺不仅是引起AR速发反应，导致一系列临床急性期症状的重要效应性介质，同时也可能通过HR1影响DCs等免疫细胞的功能，并影响IL?12等细胞因子的产生，从而在变应性炎症的维持方面起着重要作用.

    本研究我们仅通过HR1拮抗剂初步研究了AR动物模型中HR1受体对IL?12及DCs的作用, 没有涉及其他受体, 而实验中使用S?100标记DCs缺乏高特异性，这些方面有待在今后的研究中克服和完善.

    综上所述，我们的研究结果表明，AR大鼠血清IL?12含量减少以及DCs数量增加可能是变应性鼻炎发病的一个重要因素，组胺HR1拮抗剂可以抑制IL?12和DCs的这种变化趋势, 这或许是组胺HR1拮抗剂在AR中发挥作用的机制之一.

【】
  ［1］ 章如新，江德胜，周水淼,等. P物质能神经阻滞剂治疗变应性鼻炎的实验研究［J］. 中华耳鼻咽喉科杂志，1994，29(5):282-285.

［2］ Krouwels FH, Hol BEA, Lutter R, et al. H istam ine affects interleukin?4, inter?leukin?5, and interferon?γ production by human T cell clones from the airway and blood［J］. Am J Respir Cell Mol Biol, 1998,18:721-730.

［3］ Caron G, Delneste Y, Roelandts E, et al. Histamine polarizes human dendritic cells into Th2 cell?promoting effector dendritic cells［J］. J Immunol, 2001,167:3682-3686.

［4］ Jutel M, Watanable T, Akdis M, et al. Immune regulation by histamine［J］. Curr Opin Immunol, 2002,14:735-740.

［5］ Akdis CA, Blaser K. Histamine in the immune regulation of allergic inflammation［J］. J Allergy Clin Immunol, 2003,112:15-22.

［6］ Damaj BB, Becerra CB, Esber HJ, et al. Functional expression of H4 histamine receptor in human natural killer cells, moncytes, and dendritic cells［J］. J Immunol, 2007,179(11):7907-7915.