核因子NF?κB对帕金森病MPTP模型小鼠黑质COX?2表达的影响

【摘要】  目的: 研究核因子（NF?κB）在1?甲基?4?苯基?1,2,3,6?四氢吡啶(MPTP)所致小鼠帕金森病(PD)模型中的影响和对环氧合酶?2(COX?2)的表达调控作用以及人参皂甙Rg1对其的影响，探讨导致多巴胺(DA)能神经元变性失活的可能机制. 方法: 采用MPTP制备亚急性PD小鼠模型,用免疫组织化学法和免疫蛋白印迹法观察小鼠黑质区酪氨酸羟化酶(TH),COX?2，前列腺素E2（prostaglandine2，PGE2）以及NF?κB的表达变化；并观察给予人参皂甙Rg1对上述变化的影响. 结果: 与对照组小鼠相比,模型组小鼠出现典型PD症状,在MPTP第5次注射后24 h，黑质区NF?κB（34.6±5.6），COX?2（28.2±5.1）, PGE2(36.1±4.2)阳性细胞较对照组NF?κB（2.5±0.8），COX?2（1.0±0.3）, PGE2(3.2±0.4)阳性细胞显著增加(P<0.01), TH阳性神经元显著丢失60%(P<0.01)；经人参皂甙Rg1处理后,模型组小鼠PD症状减轻,与模型组比较,黑质区NF?κB（4.9±2.1），COX?2 （1.9±0.7）,PGE2(4.6±0.3)阳性细胞明显减少(P<0.01)，TH阳性细胞数较对照组仅下降32%. 结论: 核因子NF?κB在亚急性PD模型早期对黑质COX?2表达中可能起重要调控作用；人参皂甙Rg1可能影响NF?κB及C0X?2表达而对小鼠多巴胺神经元起一定保护作用.

【关键词】  帕金森病；炎症；环氧合酶?2；前列腺素E2；核因子NF?κB；人参皂甙Rg1

    0引言

    帕金森病(parkinson?s disease，PD)是一种常见的中枢神经系统变性疾病. 有研究［1］认为,炎症可能在PD发病过程中起重要作用, 环氧合酶?2(cyclooxygenase?2，COX?2)及其介导的炎症反应可能参与PD发病过程［2］. 核因子(nuclear factor?κappaB, NF?κB)在炎症反应过程中发挥重要作用，近期的研究显示NF?κB的激活与PD发病有关［3］. 但有关NF?κB是否参与PD模型中COX?2表达调控的报道少见. 本研究采用1?甲基?4?苯基?1,2,3,6?四氢吡啶（1?methyl?4?phenyl?1, 2, 3, 6?tetrahydropyridine,MPTP）制备亚急性PD模型,观察模型动物中脑黑质NF?κB和COX?2及其产物前列腺素E2（prostaglandine2，PGE2）表达与小鼠黑质区酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)阳性神经元数量关系及给予人参皂甙Rg1后对上述变化的影响,探讨NF?κB在PD发病过程中的分子机制，为探索PD有效防治措施提供线索.

    1材料和方法

    1.1材料健康雄性C57BL/6N小鼠45只，8~12 wk龄，体质量25~30 g［北京维通利华实验动物技术有限公司SCXX(京)2002?0003］,小鼠均自由进食饮水,室温（25±2）℃，单笼喂养，光照. MPTP(美国Sigma公司)；兔抗人PGE2 mAb(美国Cayman公司)；小鼠抗人TH mAb(美国Chemicon公司)；人参皂甙Rg1（吉林大学基础医学院化学教研中心）；兔抗人COX?2 mAb,兔抗人NF?κB（p50）多克隆抗体, 浓缩型免疫组织化学超敏UltraSensitiveTMSP试剂盒(福州迈新生物).

    1.2方法

    1.2.1动物分组和模型制备实验随机将小鼠分为3组，每组15只. 模型组(PD组)：给予MPTP 30 mg/kg,盐水溶，腹腔注射,1次/d,连续5 d. 人参皂甙Rg1干预组 (Rg1组)：除给予PD组相同的MPTP处理外,MPTP注射前3 d定时给予人参皂甙Rg1 10 mg/kg,盐水溶，腹腔注射，并在MPTP注射前2 h注射人参皂甙Rg1. 溶剂组（对照组）：注射与PD组和Rg1组等体积的盐水. 上述动物均于MPTP第5次注射后24 h处死. 于每次注射药物后观察小鼠是否出现静止震颤、肌肉僵直、运动迟缓等PD行为学表现, 判断PD鼠模型是否成功.

    1.2.2免疫组织化学检测小鼠麻醉后,行40 g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液常规灌注固定,迅速开颅取脑,40 g/L多聚甲醛固定48 h(4℃)后,石蜡包埋切片. 实验时取脑组织切片常规脱蜡至水后,用TBST(pH7.4±0.2) 洗涤；组织抗原行水浴法热修复；30 mL/L过氧化氢阻断内源过氧化物酶,正常非免疫动物血清室温孵育10 min；同一组织相邻切片分别加入一抗即兔抗人COX?2 mAb(1∶100)、兔抗人PGE2 mAb（1∶300）、兔抗人NF?κB（p50）多克隆抗体（1∶100）、小鼠抗人TH mAb(1∶400), 4℃过夜；TBST洗涤后,加入生物素标记第二抗体室温孵育；TBST洗涤,加入链霉素抗生物素蛋白?过氧化酶室温孵育20 min,DAB显色,中性树胶封固,光镜下观察照相.

    1.2.3Western Blot小鼠麻醉后取脑,分离中脑黑质部分,置入细胞裂解液中,低温匀浆,4℃震荡30 min后,12 000 g 4℃离心15 min,取上清,-80℃保存备用. 实验时取标本蛋白定量后加入4倍体积样本缓冲液,95℃变性5 min. 取20 μg样品在100 g/L十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS?PAGE）上电泳后,电转至硝酸纤维素膜,以标准蛋白Marker为参照，依Mr大小切取条带,取相应条带分别加入COX?2一抗(1∶400)，PGE2 一抗（1∶600），NF?κB（p50）一抗（1∶200）和TH一抗(1∶1000), 4℃过夜,TBST冲洗后,分别与生物素标记的羊抗兔/小鼠IgG抗血清(1∶200)室温震荡孵育2 h,TBST洗涤后,与卵白素?辣根过氧化物酶复合物室温下孵育0.5 h, DAB显色. 将特异性蛋白条带扫描后,在同一条件下应用CMIAS真彩医学图像分析系统测定条带平均灰度值.

    统计学处理:选定黑质所在区域,采用CMIAS真彩色医学图像免疫组化自动分析系统进行阳性细胞计数. 各组每只动物的3张脑片数值相加后取平均值,实验结果采用SPSS11.0统计软件进行统计学分析. 组间比较采用单因素方差分析和SNK?q检验，两变量间关系分析采用简单线性相关分析法. P<0.05为差异具有统计学意义.

    2结果

    2.1行为学观察PD组小鼠于第1次注药后10~ 20 min均出现不同程度的震颤、竖毛、翘尾,MPTP第5次注射后,PD组小鼠出现步态蹒跚、活动减少、动作变慢等症状；对照组未出现上述行为学变化；Rg1组与PD组相比较，上述行为学症状明显减轻.

    2.2免疫组化检测

    2.2.1黑质区TH阳性神经元数量变化对照组黑质致密部可见大量的TH阳性神经元,且排列整齐,呈条带状(图1A)；PD组（57.2±12.1）与对照组（169.7±24.6）相比较,TH阳性神经元的数目减少约60%(图1B),Rg1组（145.8±28.4）TH阳性神经元的缺失较PD组明显为轻,仅较对照组减少约32%(图1C).

    2.2.2黑质区COX?2，PGE2和NF?κB阳性细胞数量变化PD组与对照组相比较，黑质区可见大量COX?2（28.2±5.1 vs 1.0±0.3），PGE2(36.1±4.2 vs 3.2±0.4)和NF?κB（34.6±5.6 vs 2.5±0.8）阳性细胞（图2A，C，E）；Rg1组黑质区COX?2(1.9±0.7)；PGE2(4.6±0.3)和NF?κB(4.9±2.1)阳性细胞较PD组有显著减少（图2B，D，F）. 图像分析结果显示，PD组，Rg1组和对照组间差异均有统计学意义（P<0.01）. 同时COX?2，PGE2间存在正相关关系（r=0.576，P<0.05）；COX?2和NF?κB间也存在正相关关系(r=0.588, P<0.05).

    2.3Western Blot检测在预染蛋白标准分子质量20×103，72×103，50×103和61×103处,分别可见PGE2，COX?2，NF?κB和TH特异性蛋白条带. 灰度分析发现,PD组与对照组相比，TH的表达下降约为65％，而NF?κB和COX?2，PGE2的表达则明显升高(P<0.01)；Rg1组与对照组相比较，TH表达量下降约为36％，NF?κB，COX?2和PGE2的表达较模型组均显著降低(P<0.01)；对照组仅有少量NF?κB，COX?2和PGE2的蛋白表达（图3, 表1）. 表1各组小鼠中脑黑质TH，COX?2，PGE2和NF?κB蛋白表达水平

    3讨论

    PD是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,主要病理改变是中脑黑质DA能神经元进行性变性缺失. 我们采用MPTP复制的小鼠模型具有PD典型行为学表现；Western Blot结果显示腹侧中脑TH蛋白的表达下降,提示此模型存在DA能神经元大量丢失,说明本实验PD模型符合实验要求［4］.

    近年来有研究表明,PD中存在炎症,是PD患者黑质DA缺失重要原因［5］. 炎症介质PGE2及其合成限速酶C0X?2可作为炎症反应的重要生物学指标［6-7］. 实验中我们检测了三者表达情况，发现PD组COX?2，PGE2均大量表达，同时伴有中脑腹侧TH表达水平急剧下降，这些都提示PD组小鼠脑内存在严重的炎症反应，并可能与DA能神经元丢失有关［2］，说明COX?2可能通过介导炎症反应,而参与DA能神经元丢失过程. 因此，研究COX?2表达的调控机制，将对探讨DA神经元的保护机制起重要作用. 有研究［3］发现，NF?κB作为促炎症基因表达的枢纽之一,可诱导COX?2表达，且NF?κB的激活与PD的病理机制有关. 为明确NF?κB是否参与COX?2表达及与DA能神经元变性丢失的关系，我们观察了上述三者在中脑黑质区的表达情况，结果发现PD组NF?κB，COX?2表达明显升高，且两者间存在正相关关系(r=0.5838, P<0.05),TH表达明显下降（P<0.01）. 我们推测，在本实验条件下MPTP可能激活NF?κB,继而促进COX?2和PGE2的表达,从而影响DA能神经元的变化，其结果与报道一致［8］.

    人参皂甙Rg1具有抗炎、抗氧化等作用. 有报道称Rg1对MPTP致黑质区DA能神经元的损伤有一定保护作用［9］. 为探讨人参皂甙Rg1对DA能神经元的保护途径,我们对小鼠给予人参皂甙Rg1干预，发现NF?κB阳性细胞以及蛋白水平较PD组有明显减少，相应黑质区TH阳性细胞数量和蛋白水平较PD组降低程度减轻. 可能的原因是Rg1通过减少NF?κB表达来抑制COX?2表达,减轻其介导的炎症反应,使黑质DA能神经元免于MPTP诱导的损伤，最终起到保护DA神经元作用［10］.

    综上所述，核因子NF?κB可能是MPTP所致亚急性PD模型中脑黑质COX?2表达及其介导的炎症反应的重要上游事件；人参皂甙Rg1可对核因子NF?κB产生影响进而对黑质DA能神经元起一定的保护作用.

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［10］ 杨海东,姜宏,宋宁,等. 人参皂甙Rg1对MPTP致帕金森病模型小鼠多巴胺能神经元保护作用研究［J］. 解放军药学学报，2007,23（1）：17-20.