小叶榕水提物对HBsAg和HBeAg体外抑制作用的实验研究
作者：刘妮 肖会泉 沈海容 杨丽
【摘要】 目的：观察小叶榕水提物对2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响，探讨小叶榕水提物体外抗HBV作用。方法：通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察小叶榕水提物对2.2.15细胞的影响，采用ELISA法检测分析小叶榕水提物对2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用。结果：小叶榕水提物对2.2.15细胞的半数毒性浓度为0.263mg/ml，该浓度对HBsAg、HBeAg的抑制率分别达87.7%、93.6%，指数分别为2.25和2.31。结论：小叶榕水提物有较好的体外抑制HBV作用，具有潜在的抗HBV开发前景。
【关键词】 小叶榕水提物 2.2.15细胞株 抗病毒 HBsAg HBeAg
小叶榕叶为桑科植物榕树Ficus microcarpa L.f.的叶，异名落地金钱(《本草求原》)。全世界榕树有八百多种，主要分布在热带亚热带地区。我国榕属植物约100种，属热带雨林的关键种类，主要分布在福建、广东、广西、海南、浙江和等地区，为当地的主要植物品种之一。入药主用其叶Folium Fici Microcarpae。有研究表明[1]，小叶榕叶中主要含黄酮、三萜类、齐墩果酸、脂肪族化合物和甾体化合物等。其中黄酮类和内酯类等有效成分对治疗冠心病、老年性痴呆、脑血栓、神经系统疾病和消除自由基、抗炎、抑菌、抗癌等方面有显著效果，无毒副作用，并以此开发出多种药品和保健食品[2]，但抗病毒作用未见报道。为探索小叶榕水提物治疗病毒性肝炎的疗效和机制，本实验通过观察小叶榕水提物对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用，探讨小叶榕水提物可能的体外抗乙型肝炎病毒作用，为进一步研究小叶榕水提物治疗病毒性肝炎和其他病毒性疾病提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材 料 ①小叶榕水提物(广州中医药大学热带医学研究所药剂室提供)。药物处理临用时以小叶榕水提物配制成浓度为100mg/ml的原液，用DMSO溶解，实验前用时以含2%血清、380(g/ml G418的DMEM 高糖培养液倍比稀释为： 2.1、1.05、0.53、0.26、0.13、0.07、0.03、0.02mg/ml等8个所需浓度。②2.2.15细胞株(中国人民解放军空军广州总病毒研究室)。③高糖DMEM 培养液、G418(GIBCO公司);胎牛血清[中国医学院血液学研究所(天津) (56℃ 、30分钟灭活)];谷氨酰胺、MTT、二甲基亚砜(DMSO)和胰蛋白酶均(Sigma公司);HBsAg、HBeAg ELISA检测试剂(华美生物工程公司)。青霉素、链霉素(华北制药有限公司);细胞培养瓶(Corning公司);细胞培养板(cosmo公司);-86℃ 超低温冰箱(Reveo);二氧化碳培养箱(Napco);宝特ELx800全自动酶标检测仪(美国);倒置显微镜(Olympus，BX60)。
1.2 方 法
1.2.1 2.2.15细胞培养 细胞用0.06%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化，用DMEM 高糖培养液培养，培养液临用时添加胎牛血清至终浓度为10%，G418终浓度为380μg/ml，谷氨酰胺终浓度为0.03%，青霉素、链霉素各为100IU/ml，用0.238%Hepes调pH值至6.8。将细胞制成单个悬液后移入培养瓶，置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养，每3～4天传代1次。
1.2.2 细胞毒性实验 用0.06%胰蛋白酶消化并将2.2.15细胞轻轻吹打分散成单个细胞悬液，用含10%胎牛血清的DMEM 培养液配成细胞浓度为5×104个/ml的细胞悬液，按0.1ml/孔分种于96孔板，置37℃ 、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养，24小时后加用含药培养维持液0.1ml/孔，每个浓度加4孔。以小叶榕水提物原液作系列两倍稀释，配制成含2%胎牛血清的不同浓度的细胞维持液，分别为以下8个浓度(2.1、1.05、0.53、0.26、0.13、0.07、0.03、0.02mg/ml)。然后按0.1ml/孔分种各孔，置于37℃ 、饱和湿度、5%CO2培养箱内继续培养，待药物与细胞作用5天，观察细胞形态及其生长状态后，轻轻吸取培养细胞上清液以备ELISA法测定HBsAg、HBeAg，所余细胞用MTT法测定药物细胞毒性，实验另设含2%血清、380μg/ml G418的DMEM培养液空白对照组和细胞对照组各4孔。测定药物对细胞生长的半数毒性浓度：按Sargent JM等建立MTT法检测[4]。向前述所余细胞加入400μg/ml MTT 0.1 ml/孔，置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内孵育4小时，即可见有黄黑色甲瓒颗粒，轻轻吸去MTT液但不接触细胞层，继则加入100%DMSO 0.1ml/孔，37℃ 、5%CO2培养箱内密闭孵育待甲瓒颗粒完全溶解(约10min)后，用酶标仪在490nm 波长处作比色法测定各孔A(OD)值，空白对照设4孔，加100%DMSO 0.1ml/孔，测得4孔A值后取平均数，细胞破坏百分率和细胞半数毒性浓度(TC50)。
1.2.3 培养细胞上清液中HBsAg 、HBeAg的检测 用前面所留取培养细胞第5天的上清液，用ELISA法测定HBsAg、HBeAg。其试剂盒购自华美生物工程公司，按说明书操作。取所测的4孔A值求平均数，计算小叶榕水提物抑制抗原的半数有效浓度(IC50)。
2 结 果
2.1 药物效价评定标准 依据小叶榕水提物对HBsAg 、HBeAg的抑制作用情况，本实验选择HBsAg、HBeAg作为药物效果的初步筛选指标，通过MTT法测定药物的细胞毒性浓度，并计算出相应治疗指数(TI)来评价药物临床应用前景，用TI的数值范围评价小叶榕水提物抗乙肝病毒的活性。TI≥2：有效低毒;1
2.2 小叶榕水提物对2.2.15细胞的毒性作用 经用MTT染色法检测，小叶榕水提物随浓度降低对2.2.15细胞破坏率逐渐降低，在0.53mg/ml时，破坏率<50%，见表1。表1 小叶榕水提物对2.2.15的细胞毒性作用“-”细胞生长良好，破坏率为负值;“+”细胞破坏1%～24%;“++”细胞破坏25%～49% ; “+++”细胞破坏50% ～74%： “++++”细胞破坏75%～100%。
2.3 小叶榕水提物对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用 小叶榕水提物随浓度递增，其对HBsAg、HBeAg抑制率逐渐增高。在半数毒性浓度下其抑制2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制率分别为55.7%～87.7%、54.2%～93.6%，抑制2.2.15细胞分泌HBsAg半数有效浓度(IC50)为0.117mg/ml，抑制2.2.15细胞分泌HBeAg的半数有效浓度(IC50)为0.114mg/ml,见表2。表2 小叶榕水提物对2.2.15细胞分泌HBsAg 、HBeAg的抑制作用
2.4 小叶榕水提物的指数 小叶榕水提物抑制2.2.15细胞分泌HBsAg的TI为2.2.5，抑制2.2.15细胞分泌HBeHg的TI为2.31，均大于2，表明小叶榕水提物能够显著抑制2.2.15细胞分泌HBsAg 、HBeAg ，具有较好的体外抑制2.2.15细胞表达乙肝病毒抗原的作用。提示小叶榕水提物在体外实验中具抑制HBV的作用。
3 讨 论
2.2.15细胞株是用共转染法将克隆的HBV DNA及抗G418质粒转入肝癌细胞株HepG2所建立的细胞株，能转录、翻译HBV基因，并能稳定地分泌HBsAg 、HBeAg和完整的Dane颗粒[4]，是目前国内外公认和常用的体外评价抗HBV药物的细胞模型。
小叶榕具有祛风清热、活血解毒、散淤理湿等功效。其叶、皮、果等提取的浸膏是治疗咳嗽、感冒类中成药的主要原料[5]。石钺等[6]推断黄酮类成分可能是银翘散抗流感病毒作用的主要物质基础之一。而小叶榕叶中主要含黄酮类物质，其抗HBV作用可能与黄酮抗病毒作用有关。实验结果表明，小叶榕水提物对HBsAg 、HBeAg的治疗指数分别为2.25、2.31，说明小叶榕水提物对两抗原有较好的抑制作用,确有较好的体外抗HBV作用，但尚需体内实验进一步证实。
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1 刘力恒 ，王立升 ，王天文，等.小叶榕叶总黄酮含量测定、鉴别及其对羟自由基清除作用的研究.时珍国医国药，20085(19)
2 韦锦斌，黄仁彬，林 军，等.小叶榕水提物和醇提取物止咳平喘作用的比较研究.广西中医药，2006，29(4)：58
3 Sargent JM，Taylor CG.Appeaisal of the MTT assay as a rapidtest of chemosensitivity in acute myeloid leukemia.Br J Cancer，1989，60(2)：206?210
4 Sells M A，Chen ML.Aes G.Production of hepatitis B virus particles on He cells transfeeted with cloned hepatitis B virus DNA.Proe Nad Acad Sci USA，1987，(84)：1005?1009.
5 陈 化,吴迎春.超声波提取小叶榕水提物总黄酮的鉴别.时珍国医国药，2008，7(19)：1677?1678
6 石 钺，石任兵，刘 斌，等.银翘散抗流感病毒有效部位群中黄酮类成分研究.中药杂志，2001，5，26(5)
