血管生成抑制剂Canstatin联合豆蔻提取物治疗荷瘤裸鼠实验研究
【摘要】 目的：探讨canstatin联合豆蔻提取物对人胃癌细胞株SGC?7901胃癌模型裸鼠肿瘤生长的影响。方法：建立裸鼠原位移植人胃癌模型，将模型裸鼠随机分为Canstatin组、豆蔻提取物组、联合用药组，同时设立对照组，对原位种植胃癌的体积和抑瘤率、肿瘤微血管密度进行观察，行凋亡指数检测。结果：豆蔻提取物组、Canstatin组、联合用药组的抑瘤率分别为28.8%、38.9%、44.1%;豆蔻提取物组、Canstatin组、联合用药组、对照组的肿瘤微血管密度(MVD)分别为23.81±8.15、21.50±9.17、19.01±7.15、29.45±6.72。结论：豆蔻提取物与Canstatin均可以抑制荷瘤裸鼠移植瘤的生长，促进移植瘤细胞的凋亡，降低肿瘤微血管密度，但以联合作用效果显著。
【关键词】 荷瘤裸鼠 Canstatin 豆蔻提取物
白豆蔻属姜科植物，性味辛温，归肺、脾、胃经，具有化湿行气，温中止呕作用。常用于“胃反”、“噎膈”等病症。1995年日本药局方注解(第六改正)有白豆蔻治疗胃癌的记载。Canstatin是Kamphaus发现的一种新的血管生成抑制因子[1,2]，具有较强的抑制血管内皮细胞增殖、迁移及诱导内皮细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的作用。本实验借助荷瘤裸鼠胃癌模型，观察Canstatin联合豆蔻提取物对人胃癌细胞的影响，报道如下。
1 实验材料
1.1 实验动物 Balb/c/nu/裸鼠，SPF级，4～6周龄，体重18～20g，雄性，层流柜内分笼饲养，灭菌处理水和辐照饲料供动物自由摄取，购于扬州大学实验动物中心。
1.2 实验药物 豆蔻提取物、Canstatin扬州大学中西医结合研究所提取。
1.3 主要试剂及仪器 人胃癌SGC?7901细胞株(院上海细胞研究所);兔抗人F?Ⅷ因子相关抗原抗体试剂盒(北京中山生物技术有限公司);RPMI1640培养基(Gibco);小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);胰蛋白酶(Difco);DMSO(分析纯，Amresco);青霉素80万单位 、链霉素100万单位(华北制药股份有限公司);二氧化碳培养箱(Heraeus);倒置显微镜(Olympus);超净工作台(苏净集团安泰公司);天平(上海天平仪器厂);-20℃低温冰箱(Sanyo);-80℃超低温冰箱(Becton Dikinson)。
2 实验方法
2.1 细胞培养及传代 用含10%小牛血清的RPMI?1640培养基，在37℃5%CO2浓度，饱和湿度条件下常规培养，一般约1～2天换液1次。贴壁细胞铺满瓶底80%以上时需要消化传代。选取处于对数生长期的细胞用于实验。
2.2 造模与分组 收集对数生长期的细胞，制备成浓度为5×107/ml的单细胞悬液，后在超净工作台内于裸鼠腹股沟区皮下注射0.2ml的单细胞悬液，注射局部出现明显皮丘，7天后所有裸鼠均出现直径大于5mm的皮下结节，移植瘤模型建立，皮下移植瘤待用。
将32只裸鼠造模后随机分成豆蔻提取物组、canstatin组、联合用药组、对照组，每组8只。豆蔻提取物组给予豆蔻提取物20mg/(kg·d)灌胃及PBS 0.2ml/d腹腔注射;Canstatin组给予Canstatin 10mg(kg·d)腹腔注射及PBS 0.2ml/d灌胃;联合用药组给予豆蔻提取物20mg(kg·d)灌胃及Canstatin 10mg(kg·d)腹腔注射;对照组给予PBS 0.2ml/d灌胃及腹腔注射;各组用药均连续2周。
2.3 观察指标及方法
2.3.1 原位种植胃癌的体积与抑瘤率观察 停药后第2天处死裸鼠，剥离瘤组织，称取瘤重，通过实验组移植瘤的瘤重与空白对照组瘤重相比较抑瘤率，即瘤重抑瘤率=(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%。
2.3.2 细胞凋亡率的检测 于移植瘤周边取部分肿瘤组织，固定于70%的冰乙醇，通过研磨及胃蛋白酶消化后制备成单细胞悬液低速离心去细胞碎片，洗涤，离心分离部分细胞，于室温避光染色后上流式细胞仪进行细胞凋亡率测定[3～5]。
2.3.3 肿瘤微血管密度观察 采用免疫组化SP 法。肿瘤微血管密度(MVD)读片标准：参照Maeda等[6]报道的方法，先在低倍镜(×100)下全面观察切片以确定肿瘤内血管密度最高处，再在高倍镜(×200)下，以与周围肿瘤细胞和结缔组织成分明显区别的任何一个棕黄色染色的内皮细胞或细胞丛作为一个血管，只要结构不相连，其分枝结构也作为一个血管计数。记录5个视野内的微血管数，取其平均数作为该标本的MVD值。
2.4 统计学方法 采用SPSS10.0软件处理，方差分析。
3 实验结果
3.1 对胃癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用 豆蔻组、Canstatin组、联合组裸鼠瘤质量渐下降，抑瘤率分别为28.8%、38.9%、44.1%，与对照组比较，差异有显著性意义(P<0.05);各实验组间比较，联合组抑瘤率明显优于豆蔻组和Canstatin组，差异有显著性意义(P<0.05)，见表1。表1 各组胃癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用比较
3.2 各组胃癌裸鼠移植瘤的凋亡率、微血管密度 对照组凋亡率为8.5%，豆蔻组、Canstatin组、联合组凋亡率分别为20.9%、28.6%、35.1%，各实验组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较，各实验组微血管密度差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
4 讨 论
胃癌是源自胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，占胃恶性肿瘤的95%，死亡率占恶性肿瘤的首位。胃癌的不仅是手术切除瘤体，目前认为多种治疗手表2 各组胃癌裸鼠移植瘤凋亡率比较
与对照组比较，*P<0.05;各实验组组间比较，△P<0.05段的综合运用才能提高胃癌的治愈率。1971年Folkman首次提出, 肿瘤生长依赖于新生血管形成。新生血管供给肿瘤生长所需要的氧和营养物质，并带走代谢产物。新生血管在胃癌的生长转移中也起着关键作用。抗肿瘤血管生成过程包括对血管生成调控因子的干预，抑制血管基底膜和细胞外基质降解，抑制内皮细胞分裂游走和增殖。近年来，中药在抗肿瘤血管生成方面的研究日益增多，一些有效单体及某些中药复方经研究显示出一定的抗血管生成作用。本实验使用的Canstatin是较新的血管生成抑制因子，对其体外抑制肿瘤的生长研究及与传统抑癌中药的联合运用尚少见报道。本实验将豆蔻与Canstatin相结合，研究其对原位种植胃癌的抑瘤率、肿瘤微血管密度、凋亡指数的影响。结果表明，豆蔻提取物与Canstatin均可以抑制荷瘤裸鼠移植瘤的生长，促进移植瘤细胞的凋亡，降低肿瘤微血管密度，且以联合组作用最明显(P<0.05)，提示Canstatin与豆蔻提取物在治疗荷胃癌裸鼠的过程中可能起到协同作用，但其诱导凋亡的机制还有待进一步研究。本实验中所使用的豆蔻提取物为粗提物，其具体有效成分还有待进一步明确。
【】
1 苏 影,朱建思.Canstatin,a endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth.Chinese Journal of Cancer Research, 2004,(03):229?234
2 Yamamoto T,Tanigawa N.The role of survivin as a new target of diagnosis and treatment in human cancer.Med Electron Microse,2001,34(4):207?212
3 Altieri D C.Survivin,versatile modulation of cell division and apoptosis in cancer.Oncogene,2003,22(53):8581?8589
4 Sun SY,Hail N,Lotan R.Apoptosis as a novel target for cancer chemoprevention.J Natl Cancer Inst,2004,May,662?672
5 Longley DB,Harkin DP,Johnston PG.5?fluorouracil:mechanisms of action and clinical strategies.Nat Rev Cancer,2003,3(5):330?338
