和血益智方对 VD 大鼠学习记忆和海马的影响

                     作者：田先翔 梅琼彬 王立 袁芳 袁尚荣 吴正治 

【摘要】  目的观察和血益智方对 VD 大 鼠行为学和形态学的影响。方法动物随机分为假手术组和模型组。VD 模型制作成功后随机分为和血益智方小剂量组和大剂量组、思尔明组、生理盐水（NS）组。用穿梭箱和水迷宫检测大鼠行为学并作海马 HE 常规染色，光镜观察。结果和血益智方、思尔明均能缩短VD 大鼠穿梭箱实验主动逃避时间和遭受电击时间，减少遭受电击次数；能缩短 VD 大鼠水迷宫实验时定位航行潜伏期、游泳的路径，增加大鼠空间探索实验中穿越原目标的次数。NS 组海马细胞体积变大、核变小、有核仁消失和核固缩；除 假手术组正常外，其余各组海马细胞层次有减少，但细胞排列比较密集、细胞形态尚可。结论 和血益智方可 改善 VD 大鼠的学习记忆能力。

【关键词】  血管性痴呆；MORRIS 水迷宫；学习记忆；海马

    〔Abstract〕 Objective     To  study  the  effects  of  Hexue  Yizhi  Formula  on  learning  and  memory  and  the  morphology  of  the  hippocampal  neurons  of  the  rats  with  Vascular  Dementia  (VD).    Methods     The  rats  were  subjected for  ischemia-reperfusion  repeatedly  by  blocking  the  bilateral  common  carotid  arteries  to  establish  VD  models.  They were  divided  into  four  groups  randomly  after  the  establishment  of  VD  model.  The  treating  groups  were  administrated with  Hexue  Yizhi  Formula  (1  mL/100  g)、Hexue  Yizhi  Formula  (2  mL/100  g)、 Sermion、Natural  Salt  Solution  (NS)  respectively.  Animals  with  the  shamed-operation  were  taken  as  control.  The  behavior  changes  were  observed through  the  Shuttle  box  test  and  water  maze  test  at  the  end  of  treatment.    Results     In  shuttle  box  test  Stimulus  Frequency  (SC) 、Stimulated  Time  (ST)  and  Active  avoidance  Response  Time  (ART)  of  the  rats  were  reduced  respectively  in  Sermion、Hexue  Yizhi  Formula  (1  mL/100  g)、Hexue  Yizhi  Formula  (2  mL/100  g)   groups  than  those in  NS  group.  In  the  Morris  water  maze  test,  Stage  of  Latency  and  Pathway  were  declined  and  the  times  were  increased   markedly  acrossing  the  target.  The  structure  levels  of  hippocampal  neurons  reduced,  but  cells  were  more  normal  and intensive  in  treated  groups  except  NS  group.    Conclusion     Our  study  suggest  that  Hexue  Yizhi  Formula  can  improve  the  ability  of  the  leaning  and  memory  of  the  rats  with  vacular  dementia  and  improve  the  clinical  symptoms  of  VD.

    〔Key  Words〕     Vascular  dementia;  Morris  water  maze;  Learning  and memory;  Hippocampus

    血管性痴呆（vascular dementia, VD）是老年人多发痴呆之一，系继发于脑血管病变后的缓慢性、渐进性智能障碍。它不仅给患者带来躯体上的痛苦，也带来精神上的巨大负担。湖北中医学院名老中医田玉美教授用和血益智方 VD 有较好的临床疗效。本实验从行为学和形态学方面研究了和血益智方抗大鼠 VD 的作用，现报道如下。

    1    材料和方法

    1.1    动物及分组

    经穿梭箱实验筛选的健康正常 SD 大鼠，体重220~250 g，雄性，随机分为假手术组（10 只）和模型组。将造模成功的 VD 大鼠 40 只随机分为 HXYZ 组 1（和血益智方小剂量）、HXYZ 组 2（和血益智方大剂量）、思尔明（Sermion）组、生理盐水（NS）组，每组各 10 只。所用大鼠均由湖北省实验动物中心提供〔SPF 级，动物合格证号 SCXK（鄂）2003-0003〕。各组大鼠均常规饲养。

    1.2    试剂及器材

    Sermion（普强苏州制药有限公司，批号为0302005）、染发剂（貂油黑发霜，广东顺德市保健用品有限公司）。

    和血益智方含当归、川芎、白芍、生地、黄芪、旱莲草、女贞子、益智仁等，生药材均购自武汉市武昌区中药材公司刘有余堂药店，经我院詹亚华教授鉴定为正品。所有药材一次性水煎浓缩为125% 水煎液，用无菌玻璃瓶分装、密封，经 Co60 照射后 4℃ 保存。给药前在 40℃ 恒温水温箱中加热备用。

    Morris 水迷宫、穿梭箱实验系统（医学院北京药物所）、DR-HW-2 电热恒温水温箱（北京医疗设备厂）。切片机（Leica）、显微镜（Olympus）、显微摄像系统。

    1.3    方法

    1.3.1    模型制作及给药

    VD 模型制作及术后处理按[1]进行，夹闭大鼠双侧的颈总动脉 5 min、后复灌 1 h、连续 3次、末次灌注后永久性结扎双侧颈总动脉造 VD 模型。假手术组仅分离双侧颈总动脉，既不夹闭也不结扎双侧的颈总动脉，其他与模型组相同。

    动物造模成功后，适应性饲养 3 d 后开始给药：HXYZ 组 1、假手术组大鼠给予 125% 和血益智方水煎剂，Sermion 组给予 0.5 mg/100 g 思尔明混悬液、NS 组给予生理盐水，以上各组均按 1 mL/100 g 灌胃； HXYZ 组 2 用 125% 和血益智方 2 mL/100 g 灌胃；各组动物均用药 30 d。

    1.3.2    行为学检测

    从用药第 26 天起，分别进行大鼠穿梭箱实验和Morris 水迷宫实验。

    1.3.2.1    穿梭箱实验    大鼠穿梭箱实验每日 1 次，连续 5 d，共 5 次；每次穿梭箱实验于当天晚 6 时进行，方法参考文献[1]。

    1.3.2.2    水迷宫实验    Morris 水迷宫实验每天 2 次，连续 5 d，内容包括学习训练、定位航行（游泳时间设定为 120 s）、空间探索实验（游泳时间设定为 30 s），具体操作方法同参考文献[1]。Morris 水迷宫实验于每天白天进行。每次大鼠穿梭箱实验和Morris 水迷宫实验各组别顺序相同。

    1.3.3    病观察

    行为学检测完毕，立即断头处死大鼠，取左侧海马甲醛固定，然后作 HE 常规染色，光镜观察。

    1.4    统计方法

    各组穿梭箱实验电击次数、电击时间、主动回避时间和水迷宫实验潜伏期、穿越目标次数、路径等指标用 SPSS 10.0 软件进行 AVON（单因素方差分析）检验。根据方差齐与否，再选择相应的统计分析方法。

    2    结    果

    2.1    行为学实验结果

    2.1.1    穿梭箱实验

    和血益智方能明显缩短 VD 大鼠主动逃避时间和遭受电击时间，减少遭受电击次数（表 1），与 NS 组比较有显著性差异（P  <  0.05）。但作用不如Sermion 组。

    2.1.2    水迷宫实验

    经过和血益智方 30 d 后，药物组比 NS 组动物定位航行潜伏期缩短，游泳的路径也缩短（表2）；在空间探索实验中，30 s 内大鼠穿越原目标的次数增加（表 3）。上述指标经统计分析均有显著性差异。它们的游泳轨迹如图 1~5。

    2.2    病检测结果

    光镜下观察：假手术组海马 CA1 区、CA2 区、CA3 区、CA4 区以及齿状回等各区的分子层、锥体细胞层（颗粒细胞层）、多形细胞层之细胞排列紧密有序，颗粒细胞大小一致，核圆而大，边界及核仁可见，神经纤维排列整齐；NS 组海马 CA1 区细胞大小不规则，锥体细胞层层次减少，排列稀疏，细胞体积变大，有数量不等的小空泡，细胞核变小，结构不清，核仁消失，核固缩为三角形或多角形，神经纤维排列紊乱，神经元脱失现象明显。

    其它各组海马颗粒细胞层次有减少，但层数较模型组多，细胞排列比较密集、整齐有序，细胞缺失存在，核圆而大，边界及核仁尚清楚，胞浆内成分减少，神经纤维排列不太整齐。组织病理切片提示模型组神经元有损伤，用药物治疗后神经元损伤有所减轻。海马组织（HE 染色，400 倍）的病理切片如图 6~10。

    3    讨    论

    VD 是继发脑血管病变的中枢神经元结构和功能损害，导致患者认知、学习、记忆、理解等能力下降。不同类型的记忆有不同的神经结构和回路参与，这些神经结构的血流减少或中断，就会引起功能障碍，如不及时恢复血流，神经细胞就会肿胀、死亡[2]。因此，医学对 VD 的治疗[3]包括：①治疗原发脑血管病；②改善脑功能。所用的药物如思尔明为二氢麦角碱类药，有α受体阻断作用，能扩张颅内脑血管，改善脑血流，有比较明显的抗 VD 效果[4-6]。

    VD 的证候与中医的“呆病”、“文痴”、“健忘”、“善忘”等相当，田玉美教授从临床实践观察认为 VD 以气血亏虚、肝肾不足者居多，兼有痰瘀互病者亦不少见，治宜调和气血、滋补肝肾。方中当归辛温，血虚能补、血瘀能散，使气血调和、各有所归；川芎辛温，活血解郁、行血中之气；白芍微温，和营滋阴，与当归、地黄同用为滋阴养血之良药；生地甘寒养阴，与归芍同用有补血生血之功；黄芪炙之则温，大补元气，填空补虚（髓），为补气药之长，与四物汤同用，起益气养血之用；旱莲草、女贞子甘寒补血，滋肝肾之阴；益智仁补肾益智；法夏则辛燥，降气化浊，对本方中补气养血药起补而不滞，润而不腻的作用，故和血益智方能调和气血、滋补肝肾，填精生髓。

    中药药理学研究表明川芎有扩张脑血管、改善微循环、抑制血小板聚集的作用；黄芪、当归有促进骨髓造血、扩张血管的作用，当归还有稳定细胞膜作用；生地能增加“阴虚”动物模型脑内 M-胆碱受体的结合位点，并且可促进“血虚”动物红细胞、血色素的恢复，有显著的“生血”作用；白芍有抗血小板聚集作用。黄芪对双侧颈动脉结扎所致的动物脑缺氧有显著对抗作用，可增加小鼠的学习记忆能力。和血益智方抗 VD 的确切机制与生物活性成分有待进一步研究。

    （* 吴正治：博士研究生导师）

【】
  〔1〕田先翔, 梅琼彬, 杨伟峰. 大鼠血管性痴呆模型的制作〔J〕. 湖北中医学院学报, 2006, 8(5):13-15

〔2〕韩济生. 神经原理(第2版)〔M〕. 北京:北京医科大学出版社, 1999. 923-1063

〔3〕盛树力主编. 老年性痴呆的治疗和护理〔M〕. 北京:科学技术文献出版社, 2000. 176-184

〔4〕卢家红, 吕传真, 洪震, 等. 尼麦角林治疗血管性痴呆的前瞻性、双盲、多中心研究〔J〕. 中华神经科杂志, 2001, 34(2):88-91

〔5〕孙作斌, 张宗任, 赵淑霞, 等. 脑通治疗血管性痴呆对定向力、语言、记忆力、回忆、注意力5个因子疗效的对照研究〔J〕. 现代康复, 2001, 5(5):33-34

〔6〕张建宏, 范建中, 蒋彬. 脑通在重型颅损伤患者认知障碍中的应用〔J〕. 康复理论与实践, 2000, 6(4):153-155