大量培养诱导乳腺癌患者自体 DC 和 CIK 细胞的研究
作者：王先明 何劲松 陈伟财 王敏 闵军 邵静
【摘要】 目的 探讨获得大量乳腺癌患者自体树突状细胞（dendritic cells, DCs）和细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced cells, CIK 细胞）的可行性。方法 实验组，乳腺癌患者经外周血干细胞动员，取 50 mL 外周血分外周血单个核细胞（PBMC），用 AIM-V 无血清培养基培养 DCs 和 CIK，并设健康人对照组，用 RPMI 1640 完 全营养培养基。结果 实验组 PBMC 产出 2×108 个并诱导出 1.2×107 个 DCs 和 2×109个 CIK 细胞，显著高于对 照组（P < 0.01）。DCs 的 CD86、CD11c 和 HLA-DR 分子都有较高表达，CIK 细胞 CD3+、CD56+双阳性细胞达 到14.41%。细胞毒实验提示 CIK 细胞有强大的杀瘤活性。结论 乳腺癌患者经外周血干细胞动员，用 AIM-V 无 血清系统培养，少量外周血可诱导大量优质自体 DCs 和 CIK 细胞。
【关键词】 乳腺癌；干细胞动员；树突状细胞；细胞因子诱导的杀伤细胞
〔Abstract〕 Objective To investigate the possibility of the generation of large numbers of autologous Dendritic cells and Cytokine-induced killer cells from breast cancer patients by peripheral blood stem cells mobilized. Methods Peripheral blood stem cells of breastcancer patients were mobilized by using rh GM-CSF. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 50 mL peripheral blood of breast cancer patients (experiment) and healthy donors (control) were isolated by Ficoll gradient centrifugation respectively. Dcs from adherent PBMC were generatedby using rhGM-CSF、IL-4 and TNF-α in medium AIM-V (experiment) or RPMI 1 640 (control). CIK cells fromnon-adherent PBMC were generated by using INF-γ, IL-1β, IL-2 and anti-CD3 MoAb in medium AIM-V(experiment) or RPMI 1 640 (control). Results The number of PBMC, DCs and CIK cells is 2×108, 1.2×107 and 2×109 in experimental group, which is significant higher than that in control group (P < 0.01). The percentage of CD3+CD56+ cells in CIK cells is 14.41%. DCs highly expressed CD86、CD11 cand HLA-DR in both groups. Cytotoxic activity of CIK cell against Bel-7 402 is 20.36%, 26.62%, 34.09% and 36.12% in the rate of effect and target cells 5:1, 10:1, 20:1 and 40:1. Conclusion The study suggested that large numbers of full mature autologous Dendritic cells and Cytokine-induced killer cells can generate from breast cancer patients by peripheralblood stem cells mobilized and suit for adoptive immunotherapy of breast cancer patients.
〔Key Words〕 Breast cancer; Dendritic Cells; Cytokine-induced cells
树突状细胞（DCs）是目前发现功能最强的专职抗原呈递细胞（APC），是唯一能激发静息的 T 细胞产生免疫应答的 APC，在肿瘤免疫中具有极其重要作用[1，2] 。 CIK 细胞是非 MHC 限制细胞毒性淋巴细胞，CIK 细胞的主要效应细胞是高度增生的 CD3+、CD56+双阳性表型 T 细胞，又被称为 NK 细胞样 T 淋巴细胞，兼具有 T 淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和 NK 细胞的非限制性杀瘤优点，在体外可大量扩增[3]，DCs 和 CIK 细胞理想的过继性免疫细胞。但临床应用仍受到很大限制，一是由于常规培养基含有异种血清，二是常规由患者 PBMC 诱导达到治疗量自体 DCs 和 CIK 细胞，需大量外周血。我们对乳腺癌患者进行外周血干细胞动员和用 AIM-V 无血清培养基培养，探讨获得大量自体 CDs、CIK 细胞和建立符合临床治疗标准的培养诱导系统的方法。
1 材料和方法
1.1 材料
RPMI 1640 干粉、胎牛血清、L-谷氨酰胺（L-glutamine）和青霉素-链霉素双抗（Gibco 公司）；2-巯基乙醇（2-mercaptoethanol）均购自 Sigma 公司； Ficoll 淋巴细胞分离液（相对密度 1.077±0.001 g/mL）购自 LymphoprepTM 公司；重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素 4（IL-4）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）均购自PEPRO TECH 公司；藻红蛋白（PE）标记小鼠抗人CD11c 与 HLA-DR、异硫氰酸（FITC）标记小鼠抗人 CD86 和 CD80 荧光单克隆抗体购自 Pharmingen 公司；小鼠抗人 CD54（Clone：6.5B5）和 HLA-DR （Clone：CR/43）单克隆抗体均购自 DAKO 公司；双标记免疫细胞化学染色试剂盒购自 Maixin Bio 公司；人 IL-12（p40、p70）ELISA 检测试剂盒均购自 Diaclone 公司。
1.2 方法
1.2.1 动员乳腺癌患者外周血干细胞和分离外周血单个核细胞 乳腺癌患者皮下注射 GM-CSF 6 g·kg-1·d-1，共 5 d，第 6 天抽取外周血 50 mL，为实验组。同时取等量健康人外周血做为对照组。用 Ficoll 密度梯度离心法分离 PBMC，分离步骤按产品说明。
1.2.2 诱导 DCs 采用 GM-CSF、IL-4 和 TNF-α诱导 DCs[4]。用 AIM-V 无血清培养基将实验组 PBMC 密度调到 5×106，在 75 cm2 培养瓶，37℃、5% CO2、培养 2 h。洗去并收集非贴壁细胞备用诱导 CIK 细胞。贴壁细胞用含 800 U/mL 人重组 GM-CSF 和 500 U/mL 人重组 IL-4 的 AIM-V 无血清培养基培养，每 3 天更换新培养基及细胞因子，第 5 天加入 50 U/mL 人 TNF-α，第 7 天收获成熟 DC。对照组采用 RPMI 1640 培养基培养（含 10% 灭活胎牛血清， 2 mmol/L L-glutamine、50 mol/L 2-mercaptoethano，P-S 双抗 100 U/mL），细胞因子及培养方法同实验组。
1.2.3 诱导 CIK 细胞 参照 Wolf CIK 细胞诱导法[3]，并做必要修改。用 AIM-V 无血清培养基将实验组非贴壁 PBMC 密度调至 1×106，第 0 天培养基内加入 1 000 U/mL，培养 24 h 后加入抗 CD3 单克隆抗体 50 ng/mL，IL-1 100 U/mL 和 IL-2 300 U/mL。每 3 d 更换新培养基和细胞因子并调整细胞密度至 2×105。对照组用 RPMI 1640 培养基培养（含 10% 灭活胎牛血清，2 mmol/L L-glutamine、50 mol/L 2-mercaptoethano，P-S 双抗 100 U/mL，25 mmol/ L· HEPES），细胞因子及培养方法同实验组。
1.2.4 流式细胞 检测 DC 表型 CD86、CD11c 和 HLA-DR，检测 CIK 表型 CD3 和 CD56。
1.2.5 细胞毒分析 采用乳酸脱氢酶释放法检测 CIK 细胞的细胞毒活力。方法简述如下：在 U 形底 96 孔板行细胞毒检测每孔置靶细胞 Bel-7402 10 000 个/100 L，释放孔内靶细胞 10 000/200 L，最大释放孔内置靶细胞 10 000/200 L 含 1% TritonX-100，背景孔内置 200 L 培养基，实验孔每孔含靶细胞 10 000 个/200 L 和不同数量 CIK 细胞，效靶比例为 5:1、10:1、20:1 和 40:1，效应细胞自然释放孔每孔置等量 CIK 细胞，以上均复置 3 孔。在 5% CO2，90% 湿度，37 培养 4 h 后，将每孔培养基移入 EP 管内，250 r/min，离心 10 min，取 100 L 上清移入新 96 孔板对应孔内，每孔加入乳酸脱氢酶反应液 100 L，室温下避光反应 30 min，用酶标仪检测 492 nm 波长度吸收值 A（OD 值）。
2 结 果
2.1 PBMC 产出率
经外周血干细胞动员，50 mL 乳腺癌患者外周血可分离 2×108 单个核细胞，红细胞混合率低于 5%。50 mL 健康人外周血可分离 1.2×107 单个核细胞。两组 PBMC 产出率有非常显著性差异（P < 0.01）。
2.2 DC 的产出率及细胞表型
为大量诱导乳腺癌患者自体 DC，本研究采用 75 cm2 培养瓶进行培养，2 h 贴壁后洗去非贴壁细胞，见大量贴壁细胞。诱导 1 d 后，贴壁细胞伸展，呈高度多形性，随着 DCs 的成熟，贴壁细胞逐渐减少，第 7 天可见大量成熟 DCs。将贴壁 DCs 细胞吹起，用计数板对 DCs （大细胞）计数，共产出 DCs 1.2×107，对照组产出 DCs 1.4×106，两组 DCs 产出总数有非常显著性差异（P > 0.01），产出率无显著性差异（P > 0.05）。
2.3 CIK 细胞的产出率及 CD3、CD56 表型变化
对实验组和对照组外周血诱导 CIK 细胞 14 d 细胞总数和 CD3、CD56 表型变化进行观察。50 mL 实验组外周血单个核细胞中，非贴壁细胞共 8×107，采用 AIM-V 无血清培养基培养，经 14 d 诱导， CIK 细胞体积增大，呈明显多形性、集落生长，细胞总数为 2×109，增加 25 倍，CD3+、CD56+ 双阳性细胞达到 14.41%，CD3+ 细胞 92.01%，CD56+ 细胞 15.18%。对照组非贴壁细胞 1×107，经 14 d 诱导， CIK 细胞总数为 3.8×108，增加 38 倍，CD3+、CD56+双阳性细胞达到 7.96%，CD3+ 细胞 97.52%，CD56+ 细胞 9.97%。两组的 CIK 细胞产出总数、产出率及 CD3+、CD56+ 双阳性细胞阳性率均有非常显著性差异（P < 0.01）。
2.4 CIK 细胞的细胞毒活性
采用非放射性乳酸脱氢酶释法检测 CIK 细胞的细胞毒活性，其基本原理是，细胞溶解后释放乳酸脱氢酶，根据效靶细胞共同培养 4 h 后上清液乳酸脱氢酶浓度确定细胞溶解率。
靶细胞溶解率公式为：
经外周血干细胞动员乳腺癌患者（实验组）和未动员健康人外周血（对照组）诱导 CIK 细胞 14 d 不同效：靶比靶细胞的溶解率见图 1。
3 讨 论
近年来，对 DCs 在肿瘤免疫调节中的作用进行了深入研究，认为 DCs 是调节免疫反应的核心，已有体外诱导培养 DCs 进行肿瘤的Ⅰ期临床研究[5，6]。CIK细胞具有杀瘤活性高，对正常组织毒性低，体外可高度扩增的特点［3，7］，是理想的用于临床肿瘤过继免疫治疗的杀伤细胞。本研究设计对乳腺癌患者进行外周血干细胞动员，应用治疗级 AIM-V 无血清培养基进行 DCs 和 CIK 细胞培养，用国产市售重组 IL-2 代替进口试剂进行 CIK 诱导，并与 DCs 和 CIK 细胞标准培养诱导系统进行对照研究，探讨获得大量自体 CDs、CIK 细胞和建立符合临床治疗标准的培养诱导系统的可行性，为乳腺癌患者进行临床治疗提供依据，目前尚无类似研究。
获得大量高纯度 PBMC 是诱导大量自体 DCs 和CIK 细胞、满足临床治疗的基础。常规方法分离PBMC 产出率低，难以满足临床治疗的需要。本研究用 GM-CSF 对乳腺癌患者进行外周血干细胞动员 5 d 后，抽取 50 mL 外周血，获得了 2×108 高纯度 PBMC，显著高于对照组。采用 AIM-V无血清培养基代替 RPMI 1640 完全营养培养基，目的是为避免异重蛋白对患者引起的不良反应。经 7 d 诱导，实验组 DCs 产出量明显高于对照组，达到 1.2×107，流式细胞 CD11c、CD86 和 HLA-DR 表达显示，采用AIM-V 无血清培养系统可诱导出与 RPMI 1640 全营养培养基同样成熟的 DCs。结果显示，经外周血干细胞动员，少量抽取乳腺癌患者外周血，可大量诱导成熟 DCs，用于乳腺癌的过继性免疫治疗。
尽管一些研究报道，外周血非贴壁单个核细胞经 3 周诱导，CIK 细胞总数可增加 1 000 倍以上，我们的前期研究显示，外周血单个核细胞产出率个体差异非常大，要诱导达到治疗量的自体 CIK 细胞，仍需要抽取大量外周血或采用其它昂贵的方法，增加了治疗费用和风险。我们的研究结果显示，经外周血干细胞动员，50 mL 外周血除可大量诱导 DCs 外，经 14 d 无血清培养基和国产重组 IL-2 诱导可产出 2×109 自体 CIK 细胞，可达到临床治疗量，CD3+CD56+ 双阳性细胞阳性率高于同期对照组。诱导 14 d 细胞毒检测显示，虽然对照组细胞毒活性在效靶 40:1 高于实验组，但在效靶 5:1、10:1、20:1 均无显著性差异，具有高效的杀瘤活性。
综上所述，乳腺癌患者经外周血干细胞动员，用 AIM-V 无血清系统培养，少量外周血可诱导大量优质自体 DCs 和 CIK 细胞，可能成为对乳腺癌患者进行 DCs-CIK 序列治疗的良好方法。
【】
〔1〕Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immuneity〔J〕. Nature, 1998, 392:245
〔2〕Schmidt-WOLF GH, Negrin RS, Kiem HP, et al. Use of SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine induced killer cells with potent anti-tumor cell activity〔J〕. J Exp Med, 1991, 174:139
〔3〕Steinman RM. The dendritic cell system and its role in immunogenicity〔J〕. Annu Rev Immunol, 1991, 9:271-296
〔4〕Sallusto F, Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by culture human dendriteic cells is maintained by granulocyte/macrophage colonistimulating factor puls IL-4 and downregulated by tumor necrosis factor-α〔J〕. J Exp Med, 1994, 179:1109
〔5〕Kobayashi T, Shinohara H, Toyoda M, et al. Regression of lymph node metastases by immunotherapy using autologous breast tumor-lysate pulsed dendritic cells: report of a case〔J〕. Surg Today, 2001, 31(6):513-516
〔6〕Asavaroengchai W, Kotera Y, Mule JJ. Tumor lysate-pulsed dendritic cells can elicit an effective antitumor immune response during early lymphoid recovery〔J〕. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(2):931-936
〔7〕Schmidt-Wolf IG, Finke S, Trojaneck B, et al. Phase I clinical study applying autologous immunological effector cells transfected with the interleukin-2 gene in patients with metastatic renal cancer, colorectal cancer and lymphoma〔J〕. Br J Cancer, 1999, 81(6):1009-1016
