丙肝病毒核心基因克隆载体pGEM?HCV/core的构建

【摘要】  目的 构建丙肝病毒核心基因克隆载体pGEM-HCV/core，为进一步研究外部引导序列（external guide sequence, EGS）引导核糖核酸酶P在RNA水平阻断丙肝病毒核心基因的表达做好前期基础。方法 将含HCV全长基因的pBRTM／HCV1?301l质粒于大肠杆菌JMl09内扩增；提取pBRTM／HCV1?301l质粒；从pBRTM／HCV1?301l质粒中PCR扩增出HCV核心基因片段并将其插入pGEM?3Z克隆载体；以得到重组的pGEM-HCV/core克隆载体；最后EcoR I and Hind III双酶切鉴定HCV核心基因克隆载体。结果 pGEM-HCV/core克隆载体经双酶切、凝胶电泳证明插入片段与HCV 核心基因片段大小相符；经测序证明其插入序列与HCV core基因序列一致。结论 成功构建了HCV 核心基因的克隆载体pGEM-HCV/core。

【关键词】  HCV；core基因；载体；EGS

　　Abstract:Objective To construct the clone plasmid containing the core gene of HCV, preparing for the research of blockage of the expression of HCV core gene guided by EGS at the level of mRNA.Methods After expanding plasmid pBRTM /HCV1?3011 (containing the whole genome of HCV) through E. coli JM109. The core gene with pBRTM /HCV1?3011 is amplified with PCR as the template; The core segment was inserted into the clone plasmid pGEM?3Z. Plasmid pGEM-HCV/core was digested with EcoR I and Hind III. Results The PCR result of HCV core has correct size and sequences. Conclusion The clone plasmid pGEM?HCV/core has successfully been constructed.

　　Key words:HCV; core gene; vector; EGS

　　在HCV的众多基因片段中，核心蛋白基因具有包裹病毒核酸、维持病毒外形的功能，是导致病毒持续感染的关键因素。因此通过阻断丙型肝炎病毒核心基因的表达以抑制丙肝病毒复制的研究已受到广泛的关注。本研究旨在采用pGEM?3Z克隆载体构建pGEM?HCV/core克隆载体，为进一步研究指导序列性M1核酶(M1 ribozyme of guide sequence,M1GS)在RNA水平阻断HCV 核心基因的表达，为开展包括抗HCV疫苗和药物研发等临床应用提供重要的物质基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料
    　　
　　大肠杆菌菌株JM109，购自鼎国生物公司。用CaCl2法制备感受态菌，-80 ℃保存。质粒pBRTM ／HCV1?3011，由美国华盛顿大学Rice教授惠赠，具有HCV全长基因；pGEM?3Z克隆载体由本试验室保存。

　　1.2  主要试剂
    　
　　EcoRI、HindIII、T4 DNA连接酶及Taq酶均购自大连宝生物公司。DNA MarkerIII及DNA Marker DL2000分别购自北京奇华盛生物公司及威佳生物公司。质粒提取试剂盒购自康龙生物公司。DNA片段纯化试剂盒购自尚能生物公司。

　　1.3  引物
   
　　上游引物：5′GGCGAATTCATGAGCACGAATC CTAAAC 3′(包含EcoRI位点)；下游引物：5′CCTAAGCTTGGCTGAAGCGGGCAC 3′(包含HindIII位点)；引物由英俊生物公司合成。

　　1.4  方法

　　1.4.1  质粒的扩增及纯化
    
　　应用0.1 mol/L的CaCl2溶液制备JM109感受态菌；将质粒pBRTM／HCV1?3011及pGEM?3Z克隆载体分别转化JM109感受态菌，筛选阳性菌落，小量制备质粒DNA，经酶切及琼脂糖凝胶电泳分析选出含相应质粒的阳性细菌克隆,见图1。 将转化有pBRTM／HCV1?3011及pGEM?3Z克隆载体的细菌分别接种于含四环素和含氨苄青霉素的平板中，倒置于生化培养箱37 ℃恒温培养16 h。挑单个菌落分别接种于含四环素和含氨苄青霉素的LB液体培养基中，剧烈振荡过夜，用盖宁微量质粒提取试剂盒提取pBRTM／HCV1?3011及pGEM?3Z。

　　M：MarkerⅢ;  1：pBRTM／HCV1?3011

　　图1  pBRTM／HCV1?3011质粒（略）

　　Fig.1  pBRTM／HCV1?3011 plasmid

　　1.4.2  HCV核心基因的PCR扩增
   
　　用PCR方法以pBRTM／HCV1?301l质粒为模板扩增HCV 核心基因序列，在上游引入EcoRI酶切位点，并在下游引入BamHI酶切位点，并在两端各加入3个保护碱基。PCR的反应程序如下：94 ℃变性5 min，94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃聚合延伸反应5 min，共循环30次。PCR产物经DNA片段纯化试剂盒清洁。

　　1.4.3  克隆载体的构建
    
　　先用EcoRI、HindIII分别酶切HCV 核心基因片段（PCR回收产物）和pGEM?3Z克隆载体，经37 ℃酶切过夜后用DNA片段纯化试剂盒清洁酶切产物。然后将经双酶切的pGEM?3Z克隆载体与HCV core片段16℃连接过夜。最后将连接产物转化JM109感受态大肠杆菌，于37 ℃恒温培养16～20 h，观察结果。

　　1.4.4  克隆载体的鉴定
   
　　经氨苄青霉素培养基筛选，挑取克隆行EcoRI、HindIII双酶切以及琼脂糖电泳筛选出含有HCV核心蛋白基因片段大小的阳性克隆。阳性克隆者送英俊生物公司测序。

　　2  结果

　　2.1  质粒的扩增及纯化
    　
　　质粒pBRTM／HCV1?3011是由HCV全长基因（9.6 kb）和pBR322载体(4 361 bp)重组形成的质粒，大小约为13 961 bp,如图1所示。pGEM?3Z克隆载体大小为2 743 bp, 如图2所示。

　　2.2  HCV核心基因的PCR扩增
   
　　PCR扩增的HCV核心蛋白基因序列约为582 bp(由于HCV core序列为573 bp，再加保护碱基和酶切位点9 bp共582 bp)，PCR扩增结果见图3。

　　M：MarkerⅢ;  1：pGEM?3Z质粒

　　图2  pGEM?3Z质粒（略）

　　Fig.2  pGEM?3Z plasmid

　　M：Marker DL2000;  1：PCR results of core gene

　　图3  PCR扩增产物的凝胶电泳图谱（略）

　　Fig.3  Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of core gene

　　2.3  pGEM?HCV/core的构建
   
　　core片段经酶切、连接已成功克隆到载体pGEM?3Z中，构建了重组质粒pGEM?HCV/core（图4）。

　　2.4  pGEM?HCV/core的鉴定
   
　　用EcoRI和HindIII限制内切酶对重组质粒pGEM?HCV/core酶切鉴定显示插入片段与HCV核心蛋白基因片段大小相符 (图5)。用T7和Sp6引物对克隆片段进行DNA序列分析，测序结果证实插入片段确为HCV 核心蛋白基因序列，含有573个核苷酸。

　　M: MarkerⅢ;  1:plasmid pGEM?HCV/core 

　　图4  构建成功的质粒pGEM?HCV/core（略）

　　Fig.4  Construction of plasmid pGEM?HCV/core

　　1: PGEM?3Z?core;  2: PGEM?3Z?core digested with EcoR I and Hind Ⅲ；3.recycled core segment; M: MarkerⅢ

　　图5  pGEM?HCV/core酶切鉴定电泳图谱（略）

　　Fig.5  pGEM?HCV/core digested with EcoR I and HindⅢ

　　3  讨论
    
　　HCV核心蛋白是丙肝病毒的重要结构蛋白，它在病毒增殖和感染、慢性致病、肝细胞癌变、免疫功能障碍中起重要作用［1］。已有研究证明：HCV 核心蛋白基因在丙肝病毒的复制及增殖起着重要作用：HCV核心蛋白在病毒衣壳包装中起关键作用［2］，HCV核心蛋白是产生感染性病毒颗粒的必要因素之一［3］。HCV多呈长期慢性感染，HCV核心蛋白起极其重要的作用。慢性HCV核心蛋白能通过下调抗原提呈细胞的主要组织抗原和共刺激分子的表达同时诱导IL?10性T细胞生成而抑制由树突状细胞诱导的特异性CD4+ 和 CD8+T细胞免疫反应［4］，而致使丙肝病毒在体内不易被清除而呈慢性感染。最近研究还发现：HCV核心蛋白能通过下调干扰素介导的抗病毒基因表达致使机体HCV病毒在体内长期慢性感染［5］。在近年关于HCV致瘤性的研究中，核心蛋白被证明可与PA28（一种核蛋白酶）联合作用致使肝细胞变性、坏死甚至癌变等［6］；核心蛋白可刺激体内NO的形成，而NO早已被认为造成和促进DNA突变的重要因素，这无疑更突出了核心蛋白与HCV致癌机制的重要联系。HCV核心蛋白通过下调白细胞介素?2而诱导机体无免疫反应状态［7］，并还可上调影响T细胞内环境的无反应基因和新异基因表达［8］，致使机体免疫功能障碍。
   
　　HCV感染是我国慢性病毒性肝炎的主要病原体之一，可导致肝硬化及肝癌等严重后果。由于其基因高度变异极易慢性化，目前尚无可防治丙型肝炎的有效方法。M1GS技术是近几年快速起来的一种新型核酶反义技术［9,10］，M1GS由M1RNA及GS序列构成。其中M1RNA是埃希大肠杆菌的RNase P RNA亚单位，能识别前体tRNA的二级结构而特异切割5′端前导序列，使之形成成熟的tRNA 5′端。而GS则根据靶RNA设计而成，能与靶mRNA互补结合，形成类似前体tRNA的二级结构，能引导M1RNA对靶RNA进行靶向切割。因此M1GS能将靶RNA切割成为5′端及3′端产物。而核心蛋白是丙型肝炎病毒蛋白中最保守的蛋白之一，它在HCV病毒的复制、致病以及拮抗机体抗病毒起重要作用，因此通过EGS引导核糖核蛋白酶P在RNA水平阻断HCV核心蛋白基因的表达为抗HCV提供了一条思路。本实验采用PGEM?3Z克隆载体构建了pGEM?HCV/core载体。DNA测序结果显示，载体插入的HCV 核心蛋白基因片段含有573个核苷酸，其读码框和插入方向完全正确，保证了胞外转录产物的正确性。此基因表达载体的成功构建为EGS引导核糖核酸酶P靶向切割HCV核心蛋白RNA的研究打下基础。此基因的胞外转录、胞外切割反应等方面的工作我们正在进行。

【】
  　　［1］ IRSHAD M, DHAR I.Hepatitis C virus core protein: an update on its molecular biology, cellular functions and clinical implications［J］.Med Princ Pract,2006,15(6):405-416.

　　［2］ KLEIN K C, DELLOS S R, LINGAPPA J R. Identification of residues in the hepatitis C virus core protein that are critical for capsid assembly in a cell?free system［J］. J Virol,2005, 79(11):6814-6826.

　　［3］ MURRAY C L,JONES C T,TASSELLO J,et al.Alanine scanning of the hepatitis C virus core protein reveals numerous residues essential for production of infectious virus［J］.J Virol,2007,81(19):10220-10231.

　　［4］ ZIMMERMANN M, FLECHSIG C, LA MONICA N. Hepa?titis C virus core protein impairs in vitro priming of specific T cell responses by dendritic cells and hepatocytes［J］.J Hepatol,2008,48(1):51-60.

　　［5］ MORI Y, MORIISHI K, MATSUURA Y. Hepatitis C virus core protein: Its coordinate roles with PA28 gamma in metabolic abnormality and carcinogenicity in the liver［J］. Int J Biochem Cell Biol, 2008 Feb 2.

　　［6］ CHANG Y Z, LEI Y C, HAO Y H, et al.Study of the effect of hepatitis C virus core protein on interferon?induced antiviral genes expression and its mechanisms［J］.Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao,2007,23(6):1000-1004.

　　［7］ SUNDSTROM S, OTA S, DIMBERG L Y. Hepatitis C virus core protein induces an anergic state characterized by decreased interleukin?2 production and perturbation of mitogen?activated protein kinase responses［J］. J Virol, 2005, 79(4): 2230-2239.

　　［8］ DOMONGUEZ-VILLAR M, MUNOZ?SUANO A, ANAYA?BAZ B.Hepatitis C virus core protein up?regulates anergy?related genes and a new set of genes, which affects T cell homeostasis［J］.J Leukoc Biol, 2007,82(5):1301-1310.

　　［9］ ZHANG W J, LI H J, LI Y Q.Construction of an effective m1 GS ribozyme targeting HCMV UL97 mRNA segment in vitro［J］.Yi Chuan Xue Bao,2005,32(11):1205-1212.

　　［10］ KIM K, TRANG P, UMAMOTO S. In vitro construction of effective M1GS ribozymes targeting HCMV UL54 RNA segments［J］. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai),2005, 37(3):210-214.