利用RNAi沉默KIAA0280后对缺氧诱导大鼠神经元凋亡的影响
作者：黄海潮，潘雪刁，金桂芳，巫玮，潘琴，石磊，臧林泉
【摘要】 目的 利用RNA干扰（RNAi）技术，观察脑缺血相关新蛋白KIAA0280被特异性沉默后对正常神经元和缺氧诱导神经元凋亡的影响。方法 取新生大鼠培养至5～7 d的神经元，经由密闭容器引起缺氧诱导神经元凋亡模型。采用RNAi技术封闭KIAA0280的表达，观察该基因被封闭后对正常神经元的生长以及缺氧诱导神经元凋亡的作用和影响。结果 脂质体转染KIAA0280基因特异性siRNA 12 、24 h后对正常细胞生长具有一定的影响；在此基础上缺氧4 、8 h，发现RNAi组的神经元对缺氧诱导的神经元凋亡比对照组对缺氧更加敏感，更易受损伤。结论 KIAA0280对正常神经元具有一定的作用，并且对缺氧诱导凋亡神经元具有一定的保护作用。
【关键词】 KIAA0280；RNAi；缺氧；神经元；凋亡
Abstract:Objective To observe the effect on normal neuron and apoptosis neurons induced by hypoxia after blocking the KIAA0280 by RNAi technique. Methods Primary neurons of rats cultured for 5～7 d were put to airtight container to induce neuron hypoxia and establish the model of neuronal apoptosis. After blocking the KIAA0280 by RNAi technique, the effects on the normal neuron and neuronal apoptosis induced by hypoxia were observed.Result Transfecting the specific siRNA for KIAA0280 to neuron with liposome for 12 h, 24 h, the impacts on the normal neurons by the siRNA were observed. Then, the neurons were put in hypoxia environment for 4 h and 8 h; it is found that, compared with simple hypoxic group, the RNAi group was more sensitive and liable to be injured during apoptosis induced by hypoxia. Conclusion Application of the RNAi to silence KIAA0280 had certain impacts on the normal neurons and could promote apoptosis and death in the hypoxic-induced neuron apoptosis. It was indicated that KIAA0280 had effects on the normal neurons, and played a role in protecting hypoxia-induced apoptosis neurons.
Key words: KIAA0280; RNAi; hypoxia; neuron apoptosis
缺血缺氧脑中风的病理表现为脑缺血缺氧引起神经元凋亡、坏死，进而引起脑组织的坏死。在缺氧的早期，机体会作出应激反应，主动地产生神经保护作用，使机体免受更大的伤害，使机体能耐受一定程度的缺血缺氧损伤，这种现象被称作缺血预处理（缺血预适应）［1］。脑缺血相关新蛋白KIAA0280是臧林泉等［2］人应用该缺血理论，采用mRNA荧光差异显示技术(mRNA fluorescence differential display)研究缺血时神经元在此应激条件下基因差异的表达，从中筛选出差异表达明显的基因（上调/下调基因），以明确防治脑缺血、缺氧相关疾病（心肌、器官移植、肿瘤等）的一个或者多个新靶点。前期工作利用MCAO造成大鼠缺血缺氧动物模型，免疫组织化学和Western blot 等均证实，KIAA0280在缺血缺氧组织中出现过高表达［3］，表明其与缺血缺氧所致的细胞凋亡、死亡密切相关。但是，对于其在脑组织缺血缺氧中的具体作用，目前国内外尚未见报道。本实验采用RNAi技术沉默KIAA0280的表达，以明确KIAA0280在缺氧缺血引起的神经元凋亡中的作用，为阐明脑中风、心衰、心肌梗死等与细胞凋亡相关疾病的发病机制奠定理论基础。
1 材料和仪器
1.1 动物
SPF级SD大鼠，雌性，体质量180～250 g,由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2003-0002，粤监证字2007A006。
1.2 主要试剂 DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、优级胎牛血清（FBS）、马血清（HS）、B27、HEPEs购自美国Gibco公司。LipofectamineTM 2000购自Invitrogen公司。EDTA由Augus公司提供。Hoechst 33258、SRB由Sigma公司提供。LDH检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。siRNA由上海吉玛制药技术有限公司提供。其他试剂均为国产分析纯以上产品。
1.3 仪器
单人双面无菌操作台（苏州净化）， 细胞培养箱、低温高速离心机（美国Thermo）， 荧光显微镜（带数码相机）、倒置显微镜（德国Leica）， 酶标仪（美国Bio?Rad）等。
2 方法
2.1 原代大鼠神经元的分离与培养［4］
预先用多聚赖氨酸包被培养皿6 h以上，吸出多聚赖氨酸，风干2 h，备用。取SD大鼠乳鼠（出生1～3 d），体积分数为75%的酒精消毒，断头开颅，去脑膜，取大脑皮层神经元，放进Kreb’s解剖液（保持低温），剪碎至大约0.5 mm2，成沙泥状，用Kreb’s解剖液冲洗2～3次，0.25％的胰酶消化10 min，重复消化2～3次，将每次的消化液放入带血清的DMEM中终止消化，将细胞悬液适量吹打70～100次以分散细胞,过筛（180目），1 500 r/min离心5～8 min，去上清，再加入DMEM培养液重悬细胞，细胞计数并调整细胞数使其到2.0～2.5×105个/mL, 将其接种到预先涂以多聚赖氨酸的培养皿中。在37 ℃、5%CO2条件下培养, 培养1 d，细胞贴壁后，换液去除死细胞。在48 h后，加入胶质细胞抑制阿糖胞苷，每3天换液1次，培养1个星期，可做实验。
2.2 体外细胞缺氧模型的制备［5］
用培养了1个星期的细胞置密闭容器中，真空泵抽空，继续保持抽取30 min至抽完培养基中溶解氧，然后缓慢充入95％N2及5％CO2恢复到正常气压（在密闭容器中放一气囊指示装置），置37 ℃培养箱培养1、2、4、8、12、24 h。用Hoechst 33258［6］ 、LDH和SRB［7］判断细胞凋亡情况。
2.3 用Hoechst 33258染色检测神经元凋亡（核凋亡小体检测）
在缺氧罐中取出细胞，吸走培养基，用0.1 mol/L pH 7.2 PBS冲洗2遍，加入4％(ρ)的多聚甲醛，放在4 ℃环境中固定1 h，再用0.1 mol/L PBS冲洗5遍，再用10 μg/mL的Hoechst 33258对细胞进行染色20 min后，用0.1 mol/L PBS冲洗5遍，风干，用荧光显微镜观察凋亡细胞的核皱缩情况。
2.4 LDH试剂盒检测细胞的乳酸脱氢酶的漏出情况
从缺氧罐取出细胞，吸出培养基，500 r/min离心5 min，吸出30 μL至15 mL离心管，然后依次加入基质缓冲液，辅酶Ⅰ溶液，混匀置于37 ℃水浴15 min，再加入2，4-二硝基苯肼溶液，混匀，37 ℃水浴15 min，再加入0.4 mol/L的氢氧化钠溶液，混匀，室温放置3 min，440 nm，蒸馏水调零，测各管吸光度。设定用2 μmol/mL丙酮酸做标准液，蒸馏水做标准空白，测定空白。
2.5 SRB检测细胞存活率
从缺氧罐取出细胞，吸走培养基，用PBS冲洗细胞一遍，用50%(φ)三氯醋酸固定细胞2 h，用蒸馏水冲洗细胞3遍，加入用1％的醋酸配SRB染色30 min，再用1％的醋酸冲洗5遍，冲洗走固定不牢的蛋白，加入Tris base，在5 min内用酶标仪检测A值。
2.6 用脂质体转染siRNA入神经元内
用脂质体Lipofectamine 2000转染siRNA进入神经元内，脂质体和siRNA的质量比为4∶1。参照siRNA合成公司的建议在30 mm的培养皿中加入3 μL脂质体和3 μL siRNA，首先将3 μL脂质体溶于150 μL无血清DMEM中，混匀，室温放置5 min，同时将3 μL siRNA溶于150 μL DMEM中，然后，将脂质体和siRNA的混合一起，室温温育20 min，再加到细胞中，于12、24 h后，对转染后的细胞进行换液，再培养6 h后固定细胞。
2.7 转染后对神经元进行缺氧实验
通过以上对缺氧时间的选择可得出合适的缺氧时间，对转染后的神经元做不同时间的缺氧实验，用Hoechst 33258、SRB和LDH作转染前后的细胞的生长情况的对比，观察敲除KIAA0280后神经元的变化。具体方法如前2.2所述。
3 结果
3.1 神经元的生长形态学鉴定
正常神经元胞体较大，树突、轴突明显，神经元之间的突起联系紧密。见图1。
3.2 缺氧神经元的Hoechst 33258荧光染色
细胞凋亡一个重要的特征就是核皱缩，然后出现凋亡小体。核皱缩，核质聚集，用多聚甲醛固定细胞，再用10 μg/mL Hoechst 33258染色，凋亡细胞的核及核小体比正常细胞要小、要亮，并随着缺氧时间的延长，凋亡细胞更接近于死亡，容易被冲洗走。从图2可看出,缺氧8 h以上神经元凋亡、坏死数目没有明显改变。至24 h后，细胞明显减少，提示神经元已有部分死亡。
A.神经元形态（200×）；B.神经元形态（400×）
图1 正常神经元的形态（略）
Fig.1 The morphologies of normal neurons
A.正常神经元;B.缺氧1 h后的神经元;C.缺氧2 h后的神经元;D.缺氧4 h后的神经元；E.缺氧8 h后的神经元;F.缺氧12 h后的神经元;G.缺氧24 h后的神经元
图2 缺氧神经元的Hoechst 33258染色（略）
Fig.2 The results of neuron nucleus stained with Hochest 33258 during neuron apoptosis induced
3.3 缺氧神经元的LDH漏出测量结果
乳酸脱氢酶（LDH）是细胞内标志酶，LDH的释放与细胞膜完整性相关，当细胞膜完整性遭到破坏，膜通透性增高，胞浆中LDH大量释放到胞外，其漏出量与细胞凋亡受损程度有关，是反映神经元凋亡的简便而敏感的指标。LDH漏出增多，在紫外检测仪上表现为吸光度A值增大。随着缺氧时间增加，神经元LDH漏出增加明显，其LDH漏出变化与缺氧时间呈一定的线性关系。见表1、图3。
表1 LDH检测细胞释放的乳酸脱氢酶的浓度（略）
Tab.1 Detection of the concentration of released lactate dehydrogenase (LDH)
与正常对照组比较：* P<0.05
3.4 缺氧神经元SRB的测量结果
硫基罗丹明B（sulforhodamine B， SRB）一种蛋白结合染料,可与经三氯醋酸（TCA）固定后的细胞蛋白质的碱性氨基酸结合而显色，呈现一种明亮的粉红色,用酶联免疫检测仪测定吸光度,可提供一个敏感的细胞蛋白含量的数值,以此来细胞的存活率。细胞蛋白含量的高低与细胞数呈正相关关系，细胞数目少，蛋白含量低，表现为A值小。从表2中可看出随着缺氧时间的延长，A值变小，细胞数减少，存活率下降。细胞存活力与缺氧时间呈一定的线性关系，见图4。
表2 缺氧不同时间对神经元存活率的影响（略）
Tab.2 Impact of hypoxia on the survival rate of neuron at different time points
与正常对照组比较：* P<0.05
图3 缺氧不同时间神经元的乳酸脱氢酶漏出情况（略）
Fig.3 Percentage of LDH leakage in the neurons under hypoxia at different time points
3.5 转染siRNA的神经元
脂质体和siRNA对细胞都有一定的毒性，但其浓度在一定的范围内，对细胞的毒性作用微小，本实验采用的量均未对神经元产生较大的毒性作用，且转染效率较好（图5 B所示）。
图4 缺氧不同时间神经元的细胞存活率（略）
Fig.4 The survival rate of neurons under hypoxia at different time points
3.6 转染后siRNA后神经元LDH漏出结果
转染后，神经元状态较差，在转染后缺氧，所得的Hoechst 33258和LDH漏出结果显示，转染特异性siRNA片段后，神经元生长变差，加重缺氧神经元的凋亡情况。见表3。
A.正常神经元的Hoechst 33258染色;B.转染荧光片段FAM后的神经元（没有Hoechst 33258染色）;C.正常神经元;D.加入脂质体和siRNA后的神经元;E.转染阴性对照片段后没有缺氧神经元的Hoechst 33258染色;F.转染阴性对照片段后缺氧4 h神经元的Hoechst 33258染色;G.转染特异性siRNA片段后缺氧4 h缺氧神经元的Hoechst 33258染色
图5 转染siRNA后，对正常和缺氧神经元的影响的Hoechst 33258染色（略）
Fig.5 The result of normal and neurons under hypoxia stained with Hoechst 33258
表3 转染siRNA后正常和缺氧神经元的LDH漏出结果（略）
Tab.3 Impact of normal and hypoxia neuron with tran?sfected siRNA on the LDH leakage rate
与正常对照组比较：* P<0.05
4 讨论
诱导神经元凋亡的因素很多，不同因素诱导不同的分子生物学机制，所以在建立缺氧诱导凋亡模型时，注意控制好细胞培养的条件和环境，注意更换培养基，避免培养基的成分、pH值以及渗透压的改变而引起细胞凋亡。在对缺氧不同时间的Hoechst33258染色结果中，细胞缺氧8 h后，细胞核的皱缩情况数目相对于12 h没有明显差别，缺氧24 h，细胞数目明显减少。提示缺氧8 h后，细胞凋亡达到平台期，与报道［5］结果相近，所以在后面的实验中，缺氧时间不超过8 h。
神经元对培养基和培养环境的变化很敏感，而脂质体和siRNA对细胞有一定的毒性作用。所以利用脂质体转染基因片段后，对所得实验结论的判断应慎重。比如，杨晓红等［8］在研究RNA干扰对肺癌细胞作用中结果发现，具有特异性敲除功能的基因片段能抑制肺癌细胞的生长。其作用除了与特异性敲除片段作用外，还与加入细胞中基因片段所引起生长变化有关，即所加入细胞的基因片段，无论有无活性，对细胞生长都是有影响的。为此，本实验设计随机选择24孔板中的神经元，分别设正常细胞对照组，转染阴性片段对照组和转染活性片段组，结果显示转染无沉默活性的siRNA片段的细胞生长比正常细胞差，比转染具有沉默活性的siRNA片段好，提示特异性siRNA对KIAA0280有敲除作用。
利用siRNA降低KIAA0280表达后，结果提示在缺氧相同时间的情况下，转染特异性siRNA组的细胞比正常对照组和转染阴性对照组的细胞更容易在缺氧诱导的情况下发生凋亡。 说明KIAA0280对缺氧诱导的神经元凋亡具有保护作用。上述结果表明，KIAA0280特异性siRNA能沉默KIAA0280表达，且对正常神经元生长有一定程度的影响，并且在缺氧条件下，可加重神经元的凋亡。所以，进一步研究KIAA0280的表达、调控以及对正常和缺氧神经元的影响和信号通路将对脑缺血及其再灌注引起大脑损伤(中风、脑缺血及其再灌注)的机制提供依据,也将为防治缺血、缺氧等与细胞凋亡相关疾病（如心肌缺血、冠心病、器官移植甚至肿瘤的发生等）明确一新的靶标。
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