小鼠黑色素瘤移植瘤中血管生成拟态的时空变化
作者：张凡 孙保存 赵秀兰 常永霞
【摘要】 目的：利用小鼠移植瘤模型动态观察血管生成拟态的时空变化。方法：采用B16黑色素瘤细胞和C57小鼠制作小鼠恶性黑色素移植瘤动物模型，成瘤后根据随机数字表每天随机抽取一只小鼠处死，共12d，获得肿瘤样本114例。常规HE染色和CD31、PAS染色。显微镜下分别计数肿瘤组织中央区和外周区的高倍视野（×400）下血管生成拟态以及内皮依赖性血管。结果：在移植瘤形成的第1～8天，肿瘤组织内存在血管生成拟态。第9～12天该结构被内皮依赖性血管替代。肿瘤中央区、外周区血管生成拟态密度均呈现先递增后递减趋势；两个区域内的血管生成拟态密度比较：在第1～6天内肿瘤中央区高于外周区，在第7～8天肿瘤外周区高于中央区。内皮依赖性血管在肿瘤组织的中央区和外周区呈现递减趋势。两个区域内的内皮依赖性血管密度比较：在第1～7天肿瘤中央区内皮依赖性血管密度高于外周区，在第8～12d两个区域内的内皮依赖性血管密度无明显差别。血管生成拟态密度与肿瘤组织的坏死率之间呈密切负相关（r=-0.978,P<0.05）；内皮依赖性血管密度与肿瘤组织坏死率之间亦存在负相关（r=-0.230,P<0.05）。结论：黑色素瘤移植瘤中血管生成拟态是肿瘤细胞为适应环境而产生的一种暂时性的血液供应方式，与内皮依赖性血管并存于肿瘤组织内。随肿瘤生长变化而与内皮依赖性血管之间存在一定的时空变化。
【关键词】 血管生成拟态；肿瘤血管生成；恶性黑色素瘤
【ABSTRACT】 Objective: To study the Space?time Change of Vasculogenic Mimicry in the melanoma transplant tumour.Methods:The mouse melanoma transplant tumor model was made by Subcutaneous injecting in the C57mouse with B16 melanoma cell susspension liquid. When tumor appears, we choose one mouse each day randomly according to random number chart and kill it. Normal HE stain,immunohistochemistry stain and PAS stain were used. Then count the Vasculogenic mimicry and endothelial vessel under high?power microcope in centre and outside area. SPSS 10.0 statistic software was used when P<0.05 was significant. Results: There are PAS?positive patterned vessels in the tumor tissue at the early phase of melanoma and erythrocytes inside the vessel. The structure decreases gradually in the center and outside area and the density of the two area has no significant difference.The endothelial vessels decrease gradually in center and outside area as well. There is negative correlation between the vasculogenic mimicry density and tumor necrosis ratio(r=-0.978,P<0.05); there is also negative correlation between the endothelial vessel density and tumor necrosis ratio(r=-0.230,P<0.05).Conclusion: The vasculogenic mimicry is one sort of special blood?providing patterns and its appearance makes the tumor adapt the micronevironment more freely. This structure usually co?exist with endothelial vessel in some tumor.The vasculogenic mimicry decreases gradually with tumor development and the density of vasculogenic mimicry between center and outside area has no significant difference.The endothelial vessel also decreases gradually with tumor development and the density of endothelial vessel between center and outside area has no significant difference.The vasculogenic mimicry is more important to the tumor blood ?providing than endothelial vessel in this tumor. The CD31 plays key role in this process.
【KEY WORDS】 Vasculogenic mimicry； Angiogenesis; Malignant molenoma
血管生成拟态是一种与传统的肿瘤血管生成途径完全不同的、不依赖内皮细胞的全新的肿瘤细胞的血液供应方式。1999年由美国lowas大学的Maniotis和Folberg等提出，他们对眼葡萄膜恶性黑色素瘤微循环研究时发现恶性黑色素瘤细胞通过自身变形和与细胞外基质相互作用，模拟血管壁结构形成可输送血液的管道，从而重塑肿瘤的微循环，并且与宿主血管相连通，使肿瘤获得血液供应，命名为血管生成拟态[1～6]。
2005年10月河北北方学院学报（医学版）第5期2005年10月张 凡等：小鼠黑色素瘤移植瘤中血管生成拟态的时空变化第5期血管生成拟态概念的提出丰富了肿瘤血液供应理论，但目前对它与内皮依赖性血管之间的演变规律缺乏认识，本研究在前期研究的基础上首次提出了血管生成拟态的时空变化概念：即血管生成拟态是肿瘤血液供应的一种暂时性替代模式，在肿瘤发生的一定时期内存在，在肿瘤的不同区域存在不同的变化趋势，并利用小鼠移植瘤模型连续观察对我们的假说进行验证。
1 材料和方法
1.1 实验动物 C57小鼠购自北京军事医学院动物室，6～8周龄，共20只，雌雄各半，体重25～30g，编号后天津医科大学实验动物中心洁净实验室饲养。
1.2 实验方法 先将黑色素瘤细胞株B16复苏，1640细胞培养基上培养6d，使细胞排满瓶底，0.2%胰酶消化成单细胞悬液，调整细胞密度达到1×107/ml。75%酒精消毒小鼠鼠蹊部，每只小鼠鼠蹊部皮下注射0.2ml细胞悬液。每天观察动物生命体征及肿瘤细胞生长状况，10d后接种部位开始出现皮下肿块。根据随机数字表每天抽取一只小鼠处死，共持续12d。解剖并仔细检查动物全身，共获得肿瘤样本114例。全部标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋。
1.3 机图象处理 一抗CD31、HMB45为鼠抗小鼠单克隆抗体，即用型，6ml包装，SNATA CRUZ生产，进口分装；CathepsinD、MMP2、MMP9兔抗多克隆抗体，使用空军总医学工程研究所的BIN DAF IMG图象采集处理系统（91年版）计算每张切片中坏死面积。
1.4 计数方法
1.4.1 区域划分 中央区与外周区的划分：避开肿瘤坏死,将每张切片中肿瘤组织镜下视野均匀分成三等份，即内1/3、中1/3、外1/3三个区域，内1/3区域即为中央区，外1/3即为外周区。血管生成拟态周围与远离血管生成拟态、内皮依赖性血管周围与远离内皮依赖性血管的划分：以血管生成拟态、内皮依赖性血管为中心的高倍视野定义为血管生成拟态、内皮依赖性血管周围；距离上述视野一个高倍视野的肿瘤细胞即为远离血管生成拟态和内皮依赖性血管。血管生成拟态判断标准：无内皮细胞衬复的PAS阳性管道、衬复PAS阳性物质的肿瘤细胞围成不规则管腔，且管腔内存在红细胞，周围没有出血坏死和炎症细胞浸润。
1.4.2 计数方法 低倍镜下找到血管生成拟态和内皮依赖性血管存在的典型区域，换成高倍镜（×400），连续计数10个高倍视野内的血管生成拟态、内皮依赖性血管，取其均值即为血管生成拟态密度、内皮依赖性血管密度。同时计数血管生成拟态周围、内皮依赖性血管周围、远离血管生成拟态、远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞中各种指标阳性细胞数（各项指标均连续计数10个高倍视野，每个视野内随机计数100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其均值）。
1.5 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件包对该实验资料进行数据处理，以P<0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 肿瘤组织内的血管生成拟态的形态学特点
通过CD31和PAS双重染色，在该移植瘤的第1～8天可见到肿瘤间质中樱桃红色的PAS阳性血管样图案，在第9～12天该结构逐渐被内皮依赖性血管所替代。PAS阳性血管样图案呈现多种形状（直的、平行的、交叉的、环状的、有分支的和网状的），PAS管状结构的管壁厚薄不一，有的PAS管状结构中可以见到单行排列的红细胞。同时可见到典型的血管生成拟态样结构：外层为CD31染色阴性的肿瘤细胞，内衬樱桃红色的PAS阳性物质，管腔内有成堆的红细胞，证实恶性黑色素移植瘤中也存在血管生成拟态结构，并且具有肿瘤血液供应功能。实验中还发现有的血管生成拟态中肿瘤细胞围成的不规则管腔内无PAS阳性物质衬复，同时管腔内存在红细胞。
2.2 血管生成拟态和内皮依赖性血管在黑色素瘤不同移植时间和不同区域变化
本实验小鼠移植肿瘤组织内的血管生成拟态出现在移植瘤形成后的第1～8天，并与内皮依赖性血管共同存在。随着移植肿瘤的发展，血管生成拟态在肿瘤的不同区域呈现不同的变化趋势。肿瘤中央区的血管生成拟态密度在移植瘤形成后的第1～3天呈现递增趋势，在第4～8天呈现递减趋势。肿瘤外周区的血管生成拟态密度在第1～4天呈现递增趋势，在第5～8天呈现递减趋势。从空间上对比两个区域内的血管生成拟态密度显示：在第1～6天肿瘤中央区的密度高于外周区的密度，在第7～8天肿瘤外周区的密度高于中央区的密度。内皮依赖性血管密度在肿瘤的中央区和外周区均呈现递减趋势。空间上对比两个区域内的内皮依赖性血管密度发现：在第1～7天肿瘤中央区的密度高于外周区密度，在第8～12天肿瘤两个区域内密度差别不明显。对肿瘤中央区和外周区的血管生成拟态密度和内皮依赖性血管密度做统计学分析，结果显示两个区域内的血管生成拟态密度和内皮依赖性血管密度均无差别。表1 不同区域血管生成拟态密度的比较（个/高倍视野）表2 不同区域内皮依赖性血管密度的比较（个/高倍视野）
2.3 CD31在肿瘤不同区域的表达
显微镜下观察发现部分的肿瘤细胞表达CD31抗原，同时围成血管生成拟态的肿瘤细胞不表达或极少表达CD31抗原，血管生成拟态周围的肿瘤细胞高表达CD31抗原。统计学分析显示：血管生成拟态周围的肿瘤细胞CD31的表达高于远离血管生成拟态肿瘤细胞的表达，内皮依赖性血管周围肿瘤细胞的CD31表达与远离内皮依赖性血管肿瘤细胞的表达之间差别无统计学意义，血管生成拟态周围肿瘤细胞CD31的表达与内皮依赖性血管周围肿瘤细胞表达之间差别无统计学意义（见表3）。表3 CD31在肿瘤不同区域的表达（个/高倍视野）表4 血管生成拟态密度、内皮依赖性血管密度与坏死之间的关系
3 讨论
血管生成拟态的概念提出丰富和完善了肿瘤血液供应理论，同时也对很多恶性肿瘤对传统抗肿瘤药物耐受问题作出了很好解释。目前人们又在多种肿瘤（炎性乳癌、浸润性卵巢癌、前列腺癌）中发现了血管生成拟态。我们以前的研究证实部分双向分化肿瘤（滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤、黑色素瘤、间皮肉瘤）中也存在血管生成拟态，由此推测血管生成拟态可能是多种恶性肿瘤为适应环境而产生的一种新的血液供应模式[7]。
我们的研究中发现血管生成拟态只是在恶性黑色素移植瘤的一段时期内存在，且与内皮依赖性血管共存，说明该结构是一种暂时性的血液供应模式，在内皮依赖性血管长入肿瘤内部之前代替其行使血液供应功能，因此我们首次提出了血管生成拟态的时空变化概念。即肿瘤的内皮依赖性血管和血管生成拟态共存于肿瘤组织中；相对缺氧的肿瘤中央区血管生成拟态密度较高，而外周肿瘤组织中由于内皮依赖性血管存在缺氧状况相对较好，因此血管生成拟态密度较低；随着肿瘤的，内皮依赖性血管从肿瘤外周开始长入肿瘤内部，缓解了局部的缺氧状况，同时内皮依赖性血管占据原来血管生成拟态的空间并取代之，形成肿瘤内部完整丰富的内皮依赖性血管网。我们的实验结果部分验证了我们的假说：肿瘤中央区的血管生成拟态密度在第1～3天呈现递增趋势，外周区的血管生成拟态密度在第1～4天呈现递增趋势。这一时期正是肿瘤生长的旺盛时期，肿瘤内部的持续缺血缺氧启动了肿瘤的血管生成拟态来缓解局部的血液供应的不足，外周区尽管存在内皮依赖性血管但仍难以满足肿瘤快速生长的需要，所以外周区也出现血管生成拟态的高表达。肿瘤中央区血管生成拟态密度在第4～8天、外周区血管生成拟态密度在第5～8天呈现递减趋势，说明这时内皮依赖性血管开始长入肿瘤组织内部，缓解了肿瘤内部的供血和供氧情况，血管生成拟态部分被内皮依赖性血管所代替。同时我们看到在第1～7天这段时间内肿瘤中央区的血管生成拟态密度一直高于外周区密度，在第7～8天肿瘤外周区血管生成拟态密度高于肿瘤中央区血管生成拟态密度，说明肿瘤中央区在肿瘤发生发展的大部分时间内相对于外周区缺血缺氧状况严重，证实了我们的假说。
内皮依赖性血管长入肿瘤组织，使肿瘤获得了宿主丰富的血液供应。按照我们的推论，肿瘤组织的内皮依赖性血管的密度应呈递增趋势，但我们的实验中发现：随着肿瘤的发展，肿瘤组织内的内皮依赖性血管的密度在逐渐减少，而且肿瘤中央区和外周区的变化均呈现递减趋势。同时我们观察到在肿瘤发展的早期肿瘤内部的内皮依赖性血管密度较高，但血管不成熟，基底膜不完整。后期肿瘤内部的内皮依赖性血管出现完整的基底膜和平滑肌，血管结构逐渐成熟，血管功能逐渐完善。因此尽管肿瘤组织中内皮依赖性血管的密度在下降，但血管行使的血供功能却在提高。在第1～8天内肿瘤中央区的内皮依赖性血管密度高于肿瘤外周区密度，说明这一时期肿瘤中央区新长入的内皮依赖性血管的结构尚不成熟，具有丰富的吻合，密度高而效能低，而外周区由于优先得到内皮依赖性血液供应，血管比较成熟。随着肿瘤发展，这种差别在逐渐减少，我们在实验中观察到在第9～12天肿瘤中央区和外周区的内皮依赖性血管密度变化曲线几乎重合。
CD31即血小板—内皮细胞粘附分子—1（platelet?endothelial cell adhesion molecule，PECAM—1），是一种内皮细胞连接分子，在体内参与多种生理过程，并能介导多种配体相互作用[8]。CD31抗原广泛分布在血管的各种细胞上，免疫组化检测可作为机体血管生成的标志。我们的实验对黑色素瘤移植瘤细胞进行CD31免疫组化染色观察，发现移植瘤细胞同样表达CD31抗原，阳性率97%（111/114），表达水平随血管生成拟态的消失而递减。同时发现能形成血管生成拟态的肿瘤细胞低表达CD31抗原，血管生成拟态周围的肿瘤细胞表达该抗原且较比远离血管生成拟态的肿瘤细胞高表达CD31；同时对血管生成拟态周围各指标表达的对比分析发现，CD31抗原在肿瘤细胞血管生成拟态变化的各个阶段表达水平比较恒定；统计学分析显示CD31抗原在血管生成拟态周围的表达与血管生成拟态密度之间存在密切相关。因此我们推测CD31抗原在血管生成拟态的各个阶段都发挥作用，对维持已形成的血管生成拟态结构方面作用不明显，然而在对肿瘤细胞形成血管生成拟态方面可能起主要作用。同时对内皮依赖性血管密度与周围肿瘤细胞CD31表达作相关分析结果显示两者之间存在相关，说明内皮依赖性血管周围肿瘤细胞CD31抗原表达对内皮依赖性血管的形成具有显著影响。
我们实验中还发现高表达CD31的肿瘤细胞在间质中彼此粘附，具有连接形成管腔的趋势，同时一部分衬复在PAS阳性物质内壁的肿瘤细胞分泌CD31抗原作为一个细胞间的连接分子，使肿瘤细胞在变形后能模仿内皮细胞更好地连接在一起，构成血液通道。国内外对CD31的研究主要集中在对内皮依赖性血管形成的影响方面。SuyaYang等研究认为同时在培养的内皮细胞上也有分布，主要集中于细胞连接处[9～12]。他们利用CD31单克隆抗体可以阻断人脐静脉内皮细胞在体外培养基上形成管腔样结构，并且细胞伸长、迁移和在胶原基质中浸润形成网状结构的能力受到抑制；Alik等在研究该抗原时发现：人的脐静脉内皮细胞平铺到存在CD31抗体的培养基上，内皮细胞仍能正常地贴附到培养基上，但却不能形成细胞间的紧密连接和cobblestone外观；但是在已经形成紧密连接的内皮细胞培养基中加入该抗体则不能影响细胞间的连接，因此认为CD31参与体外培养基上内皮细胞的早期连接，但对已经形成的管腔的维持并不重要。Sunj等研究发现CD31与细胞基质中配体结合能介导细胞间信号传导，上调整合素的功能，促使内皮细胞迁移，同时CD31之间的结合可以使细胞间的连接更趋于稳定[13～16]。TanakaY等研究认为内皮细胞表面CD31可上调β1和β2整合素的粘附作用，细胞表面整合素αⅤβ3是CD31的一个重要配体，在血管生成中起着关键作用。用鼠单克隆抗体MabLM609直接作用于αⅤβ3可阻止新生血管长入种植在鸡胚绒毛尿膜的人肿瘤组织，CD31与配体结合有利于整合素介导的内皮细胞的迁移。同时有人发现高剂量CD31可抑制内皮细胞形成管腔样结构，中等剂量CD31可促进内皮细胞形成管腔样结构，因此可以肯定CD31在内皮依赖性血管和血管生成拟态形成中都发挥重要作用。不仅作为细胞表面的粘附分子介导细胞之间的粘附，而且还作为信号传导分子，通过与细胞表面的整合素分子结合将细胞外基质中信息传递导细胞内。
我们通过实验证实在黑色素移植瘤中存在血管生成拟态，肿瘤中央区、外周区血管生成拟态密度均呈现先递增后递减趋势；内皮依赖性血管在肿瘤组织的中央区和外周区呈现递减趋势；两个区域内的血管生成拟态均存在被内皮依赖性血管替代的趋势。初步验证了我们血管生成拟态时空变化的假说，这种新的肿瘤血液供应模式的形成机制和与内皮依赖性血管之间的转换关系尚不清楚，国内外的研究刚刚起步，这方面的研究尚需要今后作大量工作，以便进一步丰富和补充肿瘤血液供应理论，同时将为临床的抗肿瘤血管提供新的靶点。
【】
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