慢性GVHD狼疮样小鼠肾组织CTGF的异常表达
[关键词]慢性移植物抗宿主病；狼疮肾炎；结缔组织生长因子；小鼠
系统性红斑狼疮（systemic lupus nephritis，SLE）是继发性肾小球肾炎最常见的病因之一，是一种自身免疫介导性炎症，以肾小球、肾血管和间质的损害为特征，后期可为肾小球硬化、纤维性新月体、肾小管萎缩和间质纤维化等。既往研究证实，转化生长因子β（transforming growth factor，TGFβ）在肾间质纤维化的形成和发展过程中起重要作用。近年来国内外研究又发现，结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）是TGFβ发挥某些生物学作用的下游调控介质，对肾细胞的分化、增生及细胞外基质的合成和降解具有显著的调控作用，其在各种类型肾脏疾病中的异常表达可能是引起患者肾组织纤维化的重要机制之一。作者通过构建慢性移植物抗宿主病（chronic graft versus host disease，cGVHD）狼疮样小鼠模型，观察CTGF在该模型小鼠肾组织中的表达情况，旨在探讨CTGF在狼疮肾炎（lupus nephritis，LN）发病中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物8～10周龄雌性（C57BL/6J×DBA/2）F1杂交鼠（以下称杂交鼠）及6～7周龄DBA/2小鼠购自中山大学医学动物中心，体重 (20.17±1.20)g，清洁级。
1.2 模型的建立与分组文献[1]制作cGVHD狼疮样小鼠模型。取DBA/2小鼠脾脏、胸腺、淋巴结细胞，制成单细胞悬液（约60%脾细胞、30%胸腺及10%淋巴结细胞），于0、3、7、10d经尾静脉注射于杂交鼠，每次给予细胞数为50×106。按随机设计原则将模型小鼠分成模型组及正常对照组，每组6只。两组小鼠首次注射淋巴细胞后12周留取24h尿，处死小鼠，立即取下肾脏，一部分保存于-70℃以备提取mRNA，另一部分置于10％中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋后切片行组织病检查。
1.3 24h尿蛋白量测定用双缩脲比色法测定尿蛋白,小鼠尿液1∶5稀释后按操作说明书操作。
1.4 RTPCR
1.4.1 总RNA提取 从-70℃低温冰箱中取出肾组织，迅速用Trizol（晶美生物技术有限公司）匀浆提取总RNA。取5μl总RNA进行甲醛变性凝胶电泳，紫外灯下观察5、18、28s条带清晰提示RNA完整无降解。
1.4.2 逆转录 逆转录反应体系如下：在PCR管中加入10×逆转录缓冲液1μl， MgCl2（25mmol・L－1）2μl，Oligo dT1μl,dNTPs（10mmol・L－1）2μl，RN酶抑制剂0.25 μl，AMV逆转录酶（Takara公司）1μl，总RNA2.75μl，30℃ 10min后，42℃逆转录50min，99℃灭活逆转录酶5min，5℃ 5min，所得cDNA保存于-20℃用于PCR扩增。
1.4.3 PCR扩增 CTGF及GAPDH内参照引物用DNA Club软件设计，由上海生工生物工程公司合成，序列如下：CTGF上游引物5′atgctcgcctccgtcgcag3′，下游引物5′tcaaagatgtcattgtccccag3′，产物为1007bp；GAPDH上游引物5′gtgggc cgctctaggcaccaa，下游引物3′ctctttgtatcacg cacgatttc，产物为452bp。PCR反应体系：5×PCR 缓冲液 10μl,MgCl2（25mmol・L－1）4μl， dNTPs（10mmol・L－1）1μl,上下游引物（10μmol・L－1）各1μl，cDNA 模板1μl ，TaqDNA聚合酶（5U・μl－1）（Takara公司）0.25μl，补足双蒸水至50μl。Eppendorf AG 22331 PCR 扩增仪扩增,条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s,56℃退火40s,72℃延伸1min,共循环34次；72℃终末延伸10min 。
1.4.4 产物检测 扩增产物在含0.5mmol・L-1溴乙锭的1%琼脂糖凝胶中以4～5V・cm－1 电压降电泳45 min。于Image Master VDS 凝胶扫描仪上成像，用Totallab V 2.01 凝胶图像分析软件进行半定量分析。所有CTGF扩增产物的吸光度均以GAPDH为基准较正，以CTGF/GAPDH表示。
1.5 病理检查2μm连续切片，置多聚赖氨酸包被的载玻片上。二甲苯脱蜡，梯度酒精至水，HE染色。
1.6 免疫组织化学检测
1.6.1 SABC法免疫组织化学染色（试剂盒购于晶美生物技术有限公司） 取2μm厚石蜡切片脱蜡至水；加3%过氧化氢溶液，室温下孵育10min；滴加胃蛋白酶修复抗原，37℃孵育15min；加含10%羊血清的封闭液在室温下封闭30min；滴加兔抗小鼠CTGF多克隆抗体(1∶50,Upstate公司），4℃孵育过夜，37℃复温30min；滴加生物素偶联的羊抗兔IgG抗体，37℃孵育30min；加HRP标记的链亲和素，37℃孵育30 min；DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片。阴性对照：以PBS替代一抗。
1.6.2 免疫荧光组织化学(间接法) 取2μm厚石蜡切片脱蜡至水；加3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min；滴加胃蛋白酶修复抗原，37℃孵育15min；加含10%羊血清的封闭液在室温下封闭30min；滴加兔抗小鼠CTGF多克隆抗体(1∶50,Upstate公司），4℃孵育过夜，37℃复温30min；滴加罗丹明标记的羊抗兔荧光素IgG抗体（北京中山生物技术有限公司），37℃孵育30min。
1.7 统计学处理实验结果用x-±s表示,所得数据用SPSS 11.5统计软件进行方差分析、t 检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 24h尿蛋白量模型组小鼠24h尿蛋白总量为（7.52±0.46）mg，显著高于正常对照组小鼠的（1.09±0.24）mg，P< 0.01。
2.2 小鼠肾组织CTGF mRNARTPCR检测结果见图1。模型组小鼠与正常对照组小鼠CTGF/GAPDH分别为0.715±0.031 和0.045±0.074，前者明显高于后者(P<0.01)。1、2.模型组； 3、4.正常对照组； M.DNA marker图1 两组小鼠肾组织CTGFmRNA RTPCR产物琼脂糖凝胶电泳结果
2.3 光镜观察模型组肾小球系膜区明显增宽，基质大量增生，部分肾小球可见硬化；肾小管多灶性萎缩，管腔内可见蛋白管型及细胞管型，间质大量单个核细胞浸润并有基质沉积。免疫组织化学检测显示，正常对照组小鼠仅在肾小管见微量CTGF表达（见图2），模型组小鼠肾组织中CTGF显著表达（见图3），遍布皮质各损伤肾小管、间质浸润的单核巨噬细胞及血管内皮细胞胞浆内，并且在肾小球系膜区内有CTGF阳性细胞。间接免疫荧光组织化学显示，正常对照组小鼠肾组织几乎未见CTGF表达（见图4），模型组小鼠肾小管可见CTGF强表达（见图5），呈线形荧光。
3 讨 论
肾小管间质纤维化是几乎所有肾脏疾病到终末期肾功能衰竭的共同通路[2]，而包括LN在内许多进展性肾脏疾病均具有TGFβ1持续过度表达的特征。TGFβ1是公认的肾脏致纤维化因子之一，可促进肾间质细胞增生和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的合成和积聚，从而加重肾小球硬化和间质纤维化。图2 正常对照组小鼠仅在部分肾小管上皮细胞因而阻断TGFβ的表达也成为防治LN肾脏纤维化的一个研究方向，但TGFβ还有抑制细胞增殖、抗肿瘤和免疫调节等其他有益的生物学作用，因而长期完全阻断TGFβ的表达带来的不良后果将可能远超过其对纤维化的效果[3]。CTGF最初由Bradham在人体脐静脉内皮细胞的条件培养基中发现，是即刻早期基因中的CCN（CTGF/fisp12，Cef10/ cry61，Nov，CCN）家族成员之一[4]。它广泛表达于各种组织器官，在生理状态下，肾小球壁层、脏层上皮细胞和肾间质成纤维细胞、管周毛细管内皮细胞等均可分泌少量CTGF。在一些病理状态下，特别是在伴有细胞增生和ECM合成的肾小球系膜和小管间质病变区，CTGF表达量明显增加。肾小管间质炎症时，由成纤维细胞和肾小管上皮细胞等转化而来的肌成纤维细胞，是间质中CTGF的主要来源，表达CTGF 的细胞数量与小管间质纤维化程度成正比[5]。最近研究发现，除成纤维细胞和肌成纤维细胞外，肾小管上皮细胞也可分泌CTGF。肾小管上皮细胞分泌的CTGF可以自分泌及旁分泌的双重形式发挥作用[6]。阻断肾小管上皮细胞CTGF的表达，不仅抑制了肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化，减少其自身ECM的合成，此外，还能减少肾间质肌成纤维细胞及纤维母细胞生成ECM，并促进ECM的降解，缓解肾小管间质纤维化[7]。Hammes 等[8]研究还发现，CTGF 的表达除TGFβ的调控外，还能以旁分泌的形式作用于肾间质成纤维细胞，促使其增生，并通过促进其产生纤溶酶原激活物抑制剂1（plasminogen activator inhibitor 1，PAI1）来抑制ECM降解，从而参与肾间质纤维化和肾功能进行性损伤的过程。CTGF是介导TGFβ促成纤维细胞增生和ECM生成的下游调控因子，亦即阻断CTGF表达便可以阻断TGFβ的致纤维化效应。此外，CTGF与TGFβ有许多共同的生物学功能（如刺激细胞的增殖和ECM的沉积），但TGFβ有抑制内皮细胞生长、调节免疫及炎症细胞等有益作用，而CTGF并不具有，这些生物学功能上的差异提示，在TGFβ充当始动因素的纤维化疾病中，CTGF将可能会成为阻断纤维化的一个新的治疗靶点[9]。目前研究发现，几乎所有的纤维化疾病都存在TGFβ的过度表达，且在这些纤维化的组织中都发现CTGF与TGFβ存在共同表达，因此，采取针对CTGF生物学效应的药物或措施，可能是一种相对安全的延缓肾小管间质纤维化的新途径。本研究从mRNA和蛋白质表达两个不同水平，以正常杂交鼠肾组织中CTGF的表达为对照，观察了cGVHD模型组小鼠肾组织CTGF表达分布和表达量的变化。RTPCR、免疫组织化学及免疫荧光组织化学均发现正常对照组小鼠肾组织没有或只有极少量的CTGFmRNA转录和蛋白表达，模型组小鼠肾组织CTGF表达量显著高于前者，且在有肾小球硬化的肾组织中CTGF表达量明显升高。据此推测肾组织内CTGF的表达可能与LN肾间质纤维化程度有关，CTGF可能在LN的发病以及病变的进展过程中发挥重要作用，这为今后临床上寻找安全、有效地延缓LN肾纤维化的方法提供了新的方向。
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