胰腺癌组织中TGF
作者：曾水林,陆澄,杨鹏,朱建宝,刘培党,李涛
[关键词]胰腺癌；神经浸润；表达；转化生长因子α;表皮生长因子受体；免疫组织化学
统计表明，我国胰腺癌的发病率20年内增加了4倍，已成为临床常见的消化道恶性肿瘤之一[1]。至今对胰腺癌的发病机制了解甚少，随着分子生物学的，人们正试图从癌基因、抑癌基因及细胞周期调控等方面研究胰腺癌的发生、发展。近年来发现，神经浸润转移是胰腺癌一个重要的生物学特征[24]。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）及其配体转化生长因子α（transforming growth factorα，TGFα) 对细胞生长、恶性变、肿瘤浸润转移等病理生理过程起重要的调节作用，其表达特征与肿瘤生物学行为及临床病理特征有极其密切的关系。我们用免疫组化方法检测了31例胰腺癌及对应癌旁组织中EGFR和TGFα的表达，探讨了它们的表达与胰腺癌神经浸润的关系。
1 材料和方法
1.1 实验材料与主要试剂
1.1.1 实验材料 选取手术切除的31例胰腺癌及对应癌旁组织的归档蜡块（江苏省人民、江苏大学附属江滨医院病理科提供）。其中男性17例，女性14例，年龄37～75岁，均经病理医师诊断证实；胰头癌25例，胰体尾癌6例；根据1987年WHO胰腺外分泌肿瘤TNM分期标准判断，Ⅰ、Ⅱ期18例，Ⅲ、Ⅳ期13例。
1．1．2 主要试剂 TGFα和EGFR鼠抗人单克隆抗体(即用型)、ABC试剂盒（含有正常马血清、生物素标记二抗等）、DAB试剂盒、柠檬酸盐抗原修复缓冲液均购自北京中山生物公司。
1.2 实验方法
1．2．1 HE染色 选择胰腺癌及对应癌旁组织蜡块，常规切片，片厚4 μm，HE染色，封片，干燥后观察结果。经专业病理科医师在光学显微镜下进行形态学诊断（双盲法）后，将31例标本分为有肿瘤神经浸润和无肿瘤神经浸润两组。
1．2．2 免疫组化染色（ABC法） 石蜡切片分为两套，分别行TGFα和EGFR抗体免疫组化染色。切片脱蜡水化,磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗3 min×3次；每张片子加１滴或50 μl 3%H2O2以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温10 min；PBS冲洗5 min×3次；微波抗原修复；冷却，PBS冲洗，稍干；PBS冲洗5 min×3次；每张片子加1滴或50 μl的2%正常马血清，室温30 min；50 μl一抗，37 ℃ 60 min或4 ℃ 过夜；0.03% Tween20加PBS冲洗5 min×3次；50 μl生物素标记二抗，37 ℃ 30 min；0.03% Tween20加PBS冲洗5 min×3次；50 μl 亲和素生物素过氧化物酶复合物，37 ℃ 30 min；0.03% Tween20加PBS冲洗5 min，PBS冲洗5 min×2次；DAB成色，水洗15 min；苏木素复染，自来水冲洗返蓝，1%盐酸乙醇脱色，自来水冲洗10 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
1.3 实验结果的判断用DAB显色，淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒均视为阳性结果。阳性细胞必须细胞结构清晰、阳性颗粒定位准确、着色明显强于背景。参照Hirayama等[5]提出的阳性判断标准。EGFR和TGFα免疫组化阳性结果定位于胰腺癌细胞的胞浆和（或）胞膜中，EGFR表达以胞膜为主，TGFα则以胞浆为主，呈片状或散在分布。TGFα和EGFR共同表达：同一序号的石蜡标本连续切片，分别作EGFR和TGFα蛋白表达的免疫组化检测，如果在连续切片的两张片子中EGFR和TGFα蛋白均表达，则定义TGFα和EGFR在该标本中共同表达。PBS代替一抗作为阴性对照，阳性对照片由北京中山生物公司提供。
1.4 统计学处理 采用SAS统计软件分析系统对全部数据进行统计处理，EGFR、TGFα表达与临床病理因素之间关系的计数资料处理采用确切概率法，P<0.05认为有显著性差异。
2 结 果
2.1 HE染色结果HE染色显示，31例胰腺癌标本中组织学分级Ⅰ级者9例，Ⅱ级者11例，Ⅲ级者11。存在肿瘤神经浸润者19例，表现为神经周围间隙的完整性破坏，癌细胞浸润进入神经周围间隙、神经纤维沿神经周围间隙扩散或在神经外膜内发现癌细胞（图1）；无肿瘤神经浸润者12例。未发现肿瘤神经浸润与肿瘤患者年龄、性别及肿瘤大小、部位、临床分期、组织学分级等存在统计学上的相关性。
2.2 免疫组化染色结果免疫组化染色显示，31例胰腺癌组织中，EGFR和TGFα阳性表达者分别为21例（67.74%）和18例（58.06%）(图2、3)；对应癌旁组织仅有少量、散在腺胞细胞浆着色，但着色细胞数<5%，与胰腺癌组织比较有显著性差异（P<0.05）。胰腺癌组织EGFR和TGFα共同表达14例，占31例病例总数45.16%，而对应癌旁组织的EGFR和TGFα共同表达为0，它们之间的差异具有统计学意义（P<0.05）。另外，在邻近肿瘤的神经组织中也显示有TGFα强阳性表达（图 图1 胰腺癌神经浸润 HE×4004）。EGFR、TGFα阳性表达与患者性别、年龄及肿瘤部位、大小、临床分期、组织学分级间均无关（P>005）。在19例胰腺癌细胞神经浸润者中，EGFR和TGFα阳性表达分别为16例（84.21%）和12例(6316%)，TGFα和EGFR共同阳性表达12例(6316%)。无神经浸润者12例中，EGFR和TGFα阳性表达分别有5例(41.67%)和 6例(50.00%)，TGFα和EGFR共同阳性表达仅2例(16.67%)。有神经浸润者与无神经浸润者比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。
3 讨 论
浸润与转移是肿瘤的生物学特性之一。肿瘤浸润转移常见的途径是局部浸润、血道、淋巴道和种植转移。有研究表明，肿瘤还可以浸润周围神经，进入神经周围间隙并沿该间隙发生浸润转移,可见于胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、腮腺肿瘤、前列腺癌、头颈部基底细胞和鳞状细胞癌等，其中胰腺癌最为常见。而胰腺本身及其周围丰富的神经分布为胰腺癌易于发生神经浸润转移提供了可能[6]。胰腺癌的神经浸润转移已成为胰腺癌难以根治、术后易于复发的主要原因之一，也是独立的预后指标[2]。EGFR及其配体TGFα分别表达或共同表达异常可引发细胞内、细胞间信号转导或细胞周期调控的异常。这种异常与肿瘤发生、及预后密切相关。膀胱癌、小细胞性肺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌等存在EGFR的异常表达。关于胰腺癌组织中EGFR及其配体TGFα表达与神经浸润转移的相关性研究国内鲜有报道。我们对31例胰腺癌的研究显示，EGFR的阳性表达率为67.74%，TGFα的阳性表达率为58.06%，对应癌旁组织基本不表达或个别仅微弱表达（P<005）。这与有关报道[79]的研究结果一致，即动物胰腺癌模型中TGFα mRNA水平显著高于正常胰腺组，临床上胰腺癌患者血清TGFα也明显高于正常人。其中有肿瘤神经浸润者EGFR、TGFα表达阳性率明显高于无肿瘤神经浸润者（P<0.05）。我们还发现，TGFα在邻近肿瘤的神经组织中也存在着强阳性表达，表明神经组织也能够产生大量的TGFα。Bockman等[10]发现，TGFα与其受体EGFR在胰腺癌组织中明显高表达，两者之间的相互作用可诱导细胞的增殖，促进肿瘤的发生。当过度增殖的胰腺癌细胞触及神经组织时，神经组织表达的TGFα有可能刺激胰腺癌细胞的生长增殖，从而导致肿瘤细胞易于发生神经浸润，并沿着神经周围间隙发生转移。而且随着肿瘤生长浸润至胰腺实质之外，癌细胞来源的TGFα会逐渐减少甚至消失，这时神经组织就可能成为外源性TGFα的主要来源。由于TGFα与EGFR是受体和配体的关系，它们之间的作用有助于癌细胞沿神经组织发生浸润转移。本实验中TGFα在神经组织中的强阳性表达提示Bockman等的设想是可能的。TGFα与EGFR分别在神经组织与肿瘤细胞的过量表达为癌细胞与神经组织之间的相互作用提供了可能，增加了肿瘤细胞与神经组织的特殊亲和力,或许可以解释胰腺癌易于发生神经浸润转移这一生物学特征。在人的消化道肿瘤如肝癌、大肠癌、胃癌等肿瘤中可能存在着TGFα、EGFR的自分泌环，即细胞产生的多肽因子TGFα作用于自身的功能受体，从而执行其功能，致细胞向恶性转化，而发生转化的细胞又可分泌TGFα，因而引起TGFα和EGFR的高表达，使肿瘤细胞形成不可抑制的生长和扩散。具有TGFα和EGFR共同表达的肿瘤可表现出更强的侵袭性。Yamanaka等[11]在1993年就发现胰腺癌具有这种特点。许雅等[12]在阻断TGFα、EGFR自分泌环对胰腺癌细胞体外生长影响的研究中观察到，双重阻断TGFα、EGFR表达比单独阻断TGFα或EGFR表达作用更强，生长抑制率由78.8%提高到86.0%，软琼脂集落形成能力完全丧失。双重阻断后能明显抑制肿瘤恶性生物学行为，甚至使部分细胞恶性表型逆转，部分细胞更容易发生凋亡，表明了TGFα与其受体EGFR共同表达在胰腺癌病理行为中的重要作用。本研究显示，TGFα与其受体EGFR在胰腺癌组织中共同表达14例，而癌旁组织未见表达；存在胰腺癌神经浸润的19例中有共同表达者12例，明显高于无神经浸润者的2例（P<005）。说明由TGFα与EGFR所形成的自分泌环的异常，在胰腺癌发生、发展中也占有重要的地位。上述研究提示，TGFα与EGFR在胰腺癌中的表达情况可以作为反映胰腺癌神经浸润转移这一生物学特性的有价值的指标之一，同时联合检测其他有关生物学标志，结合临床和病理形态学指标进行综合分析，或许对客观、准确地判断胰腺癌是否存在神经浸润转移、预后判断和方法的选择更具有实际意义。致谢 江苏省人民、江苏大学附属江滨医院病理科为本研究提供了支持与指导，特此致谢。
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