金银花、连翘配伍提取物体外抗甲型流感病毒FM1株的实验研究
1 实验材料
1.1 实验药物及主要试剂、材料金银花、连翘饮片购买于辽宁中医药大学附属门诊药局，经辽宁中医药大学中药分析教研室张振秋教授鉴定为忍冬科植物忍冬的花蕾金银花和木樨科植物连翘的果实连翘；利巴韦林注射液（江苏吴中实业股份有限公司，批号：060208）；甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47（H1N1），由预防医学院病毒研究所提供，冻存于辽宁中医病毒室，经鼠肺、鸡胚传代后为FM1M9E2M1E3M2E4M1E5；9日龄尼克白种鸡胚，SPF级，购买于辽宁省益康生物制品厂；1 %鸡红细胞悬液：采集健康公鸡血，阿氏液抗凝，生理盐水1500 r/min离心洗涤3次，弃上清液，以无菌生理盐水配制成1 %悬液，4 ℃冷藏备用 [2]。
1.2 主要仪器和设备全外排Ⅱ级生物安全柜（美国Baker公司，型号：SG403TXCE）；低温高速离心机（德国Heraeus，型号：Biofuge 28RS）；台式压力蒸汽灭菌器（沈阳盛达生物设备有限公司）；电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）。
2 实验方法
2.1 JLT的制备电子天平称量金银花、连翘配伍（按银翘散原方比例1∶1[3]）饮片，放入圆底烧瓶中，加入配制好的80 %乙醇14倍量，电热套加热回流2 h；第1次提取后倾倒滤液，药渣再加80 %乙醇10倍量，加热回流1 h；合并滤液，加热浓缩，水浴箱通风橱加热挥发成膏状，置于电热烘箱内烘干，研成粉末避光冷藏备用。用于体外实验时，用生理盐水配成质量浓度为400 mg/mL溶液，高速离心机4000 r/min离心30 min，取上清,高温高压灭菌后4 ℃冷藏备用。
2.2 流感病毒增毒及其在鸡胚上半数感染量的测定将病毒原液接种于局部消毒后的9日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚接种0.1 mL，石蜡封口，33～35 ℃温箱孵育48 h，4 ℃过夜。收取尿囊液，红细胞凝集试验测血凝滴度。将增毒后的流感病毒原液系列对数稀释（10-1～10-12），分别接种在事先标记好的鸡胚尿囊腔内，每种质量浓度接种4个鸡胚，并做生理盐水对照。将注射了流感病毒的鸡胚放入33～35 ℃温箱内，48 h后取出放入4 ℃冰箱内过夜；收取尿囊液，每胚0.1 mL依次加入作好标记的血凝板上，再加入预先配制好的1 %的鸡血球0.1 mL，轻摇后40 min观察结果，用k?rber公式[2]。测得EID50为10-6.28，实验用100 EID50。
2.3 JLT最大不凝血质量浓度的测定中药中含有植物血凝素，在体外实验中往往引起红细胞凝集，造成假阳性结果。因此，应用血凝试验探讨中药体外直接抑制病毒作用，必须测定中药的最大不凝血质量浓度以去除影响因素。处理好的药液从原质量浓度始，用pH值7.4的Hank’s工作液2倍系列稀释6种质量浓度：2-1～2-6（400～12.5 mg/mL），分别加入配制好的1 %的鸡血球0.1 mL，在33～35 ℃温箱中中和2 h，测定血凝效价，同时设Hank’s液对照和病毒对照。结果测得JLT不引起血凝的最大质量浓度为100 mg/mL。
2.4 JLT及利巴韦林注射液对鸡胚最大无毒质量浓度的测定用含PS（青霉素G和链霉素混合试剂）10 %的生理盐水将药物原液做连续2倍系列稀释，至1∶512，每次抽取0.2 mL分别接种在预先做好标记的鸡胚上，每种质量浓度接种4个鸡胚，并设生理盐水对照。将接种好的鸡胚放入33～35 ℃温箱内孵育48 h，每12 h观察记录鸡胚存活情况，24 h内死亡的鸡胚不记入药物毒性作用致死数。因JLT组自原液起未发现死亡鸡胚，故将原液400 mg/mL作为药物最大无毒质量浓度。利巴韦林注射液最大无毒质量浓度为50 mg/mL。
2.5 JLT不同质量浓度、不同时间体外直接抑制病毒作用的比较研究用pH 为7.4的Hank’s工作液将JLT溶液从最大不凝血质量浓度起做系列2倍稀释3种质量浓度,每种质量浓度4支试管，分别加入等量100 EID50的流感病毒,置33～35 ℃温箱中中和1 h、4 h、8 h、14 h、16 h、24 h，测各组药物不同质量浓度、不同时间点血凝效价，同时设病毒对照和Hank’s液对照。
2.6 JLT对甲型流感病毒感染鸡胚的预防和保护作用研究
2.6.1 预防作用药物原液自TD0开始2倍比稀释3种质量浓度（400 mg/mL、200 mg/mL、100 mg/mL），每胚0.1 mL分别接种鸡胚，每种质量浓度的药液接种8个鸡胚，37 ℃孵育2 h，并设生理盐水和病毒对照；然后分别接种0.1 mL的100 EID50的病毒悬液,放入33~35 ℃温箱内48 h, 4 ℃过夜。抽取尿囊液，测定血凝滴度。
2.6.2 作用用100 EID50病毒悬液接种鸡胚，33～35 ℃孵育2 h，再分别接种与预防实验同等质量浓度的药液，每组接种8个鸡胚，并设生理盐水及病毒对照。33～35 ℃温箱内48 h, 4 ℃过夜。抽取尿囊液，测定血凝滴度。
3 实验结果
3.1 不同质量浓度JLT不同时间体外直接抑制甲型流感病毒作用结果显示，JLT可直接抑制甲型流感病毒FM1的活性，作用时间从1 h可持续到24 h，并且最大不凝血质量浓度即100 mg/mL，在各时间点均能完全抑制病毒的增殖，随着药物质量浓度的降低，对病毒的抑制作用逐渐减弱，但在某些时间范围内抑制病毒滴度仍可达到8倍或8倍以上；其中，50 mg/mL在作用4 h后抑制病毒效果显著，在4 h、8 h、14 h、16 h和24 h 5个时间点抑制病毒滴度分别达到13.7倍、27.4倍、27.4倍、27.4倍和16倍，25 mg/mL在8 h后抑制效果较好，可抑制病毒滴度16倍，在14 h可达19.2倍，以后效果逐渐减弱，16 h为12倍，24 h 8倍。见表1。
3.2 JLT对甲型流感病毒感染鸡胚的预防和保护作用
3.2.1 不同质量浓度JLT对甲型流感病毒感染鸡胚的预防作用JLT 400 mg/mL、200 mg/mL及100 mg/mL时，其血凝效价因数与病毒对照组比较，有非常显著差异（P<0.001）；病毒唑50 mg/mL时，其血凝效价因数与病毒对照组比较差异非常显著（P<0.001）；JLT在400 mg/mL时对流感病毒的预防作用明显优于阳性对照病毒唑组（P<0.05），而200 mg/mL、100 mg/mL 2种质量浓度与病毒唑组比较无显著差异（P＞0.05）。结果见表2。表1 JLT体外直接抑制IV作用表2 不同质量浓度JLT提取物对流感病毒感染鸡胚的预防作用 （±s）组别n质量浓度（mg/mL）血凝效价因数空白对照组8-病毒对照组83.0956±0.0259JLT组84001.9595±0.2608** #82002.1904±0.1254** 81002.2119±0.1992** 阳性对照组（病毒唑）8502.2837±0.2498** 注：与病毒对照组比较 **P＜0.001；与阳性对照组比较# P＜0.05
3.2.2 不同质量浓度JLT对甲型流感病毒感染鸡胚的作用JLT在400 mg/mL、200 mg/mL及100 mg/mL时，其血凝效价因数与病毒对照组比较，有非常显著性差异（P<0.001）；病毒唑50 mg/mL时，其血凝效价因数与病毒对照组比较有非常显著性差异（P<0.001）；相对于阳性对照组，各质量浓度JLT对流感病毒的治疗作用均无显著差异（P＞0.05）。结果见表3。表3 不同质量浓度JLT提取物对流感病毒感染鸡胚的治疗作用 注：与病毒对照组比较 **P＜0.001
4 讨论
流行性感冒属中医“时行感冒”的范畴，其病因为风热毒邪侵犯肺卫，肺主宣降功能失调。银翘散是清代医家吴鞠通所著外感病专书《温病条辨》的首方，以辛凉为主微佐辛温,清疏兼顾，恰中流感病毒致病病机。同时，银翘散也是临床上广泛应用抗流感病毒疗效确切的传统方剂。金银花和连翘为银翘散君药，金银花味甘辛，性寒凉，功能清热解毒，凉散风热；连翘味苦辛，性微寒，功能清热解毒，消肿散结。金银花轻宣疏散，连翘轻清透邪，二药配伍，共奏辛凉解表、清热解毒之功效。药研究证实，金银花对多种细菌及病毒均有抑制作用，并且具有较强的抗炎、抗变态反应及提高机体抵抗力的作用。胡克杰等[4]研究发现，金银花1∶20的水煎剂对流感病毒有效；此外，鸡胚内外抗流感病毒作用试验[5]证实，连翘种子挥发油乳剂对亚洲甲型流感病毒京科68-1株有明显的抑制作用。可见，在银翘散的抗病毒应用中，金银花和连翘发挥着十分重要的作用。JLT抗甲型流感病毒FM1株的体外实验是银翘散抗流感病毒系列研究的一部分，银翘散全方抗流感病毒作用在我们前期实验中已得到证实。本实验结果表明，JLT具有很强的直接杀灭流感病毒的作用，并且对流感病毒的预防及治疗作用效果显著。
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[1]黄祯祥.医学病毒学基础及实验技术[M].北京:技术出版社,1990:661.
[2]郭元吉.流行性感冒病毒及实验技术[M].北京:三峡出版社,1997:100-110.
[3]谢鸣.方剂学[M].北京:人民卫生出版社，2002:53.
[4]胡克杰,孙考祥,王璐,等.绿原酸体外抗病毒作用研究[J].哈尔滨医科大学学报,2001,35(6):430.
[5]余道军，万海同.抗流感病毒中药研究概况[J].浙江中医学院学报，2002，26（5）：70.
