抗乙酰胆碱受体单链抗体与人血清白蛋白融合基因真核表达载体的构建

           作者：魏晶，李强，范华英，李芳芳，李红花，李英信，孟繁平 

【摘要】  目的］构建真核表达体系，提高抗人乙酰胆碱受体单链抗体（ScFv637）与人血清白蛋白（HSA）融合基因（ScFv637?HSA）的蛋白表达质量.［方法］扩增ScFv637?HSA融合基因，经酶切处理后，克隆至真核载体pPIC9K，线性化处理后，电穿孔入毕赤酵母GS115.［结果］经电泳观察可见相对分子质量为2.6kbp的融合蛋白ScFv637?HSA基因和真核表达载体pPIC9K基因片段.［结论］ScFv637?HSA基因已准确地整合到毕赤酵母染色体基因组中.

【关键词】  重症肌无力；抗体；融合基因；真核表达

    Construction of eukaryotic expression vector of a fusion gene of single chain variable fragment directed against acetylcholine receptor with human serum albumin

    ABSTRACT:OBJECTIVETo increase the protein expression level of fusion gene of single chain variable fragment (ScFv637) and human serum albumin (HSA) by using eukaryotic expression system.METHODSThe fusion gene (ScFv637?HSA) was amplified and cloned into pPIC9K to construct recombinant vector pPIC9K?ScFv637?HSA. The recombinant vector was linerized and transformed into Pichia Pastoris GS115 by electroporation.RESULTSThe sizes of the fusion gene and the pPIC9K were found to be approximately 2.6kbp and  respectively.CONCLUSIONThe eukaryotic expression vector, which bears the fusion gene of ScFv637?HSA, has been successfully constructed.

    Key words:myasthenia gravis;single chain variable fragment;fusion gene;eukaryotic expression

    重症肌无力是抗乙酰胆碱受体抗体介导的依赖细胞免疫及补体参与的器官特异性自身免疫病,抗乙酰胆碱受体抗体的抗原结合片段（fragment of antigen binding，Fab）分别与神经肌肉接头处突触后膜乙酰胆碱受体上2个相邻的α亚单位结合后，通过加速乙酰胆碱受体发生抗原调变及激活补体，使乙酰胆碱受体数量减少，出现肌无力和麻痹症状［1］.由抗乙酰胆碱受体α亚单位主要免疫原区抗体制备的抗原结合片段或单链抗体（single chain variable fragment, ScFv）与乙酰胆碱受体的主要免疫原区结合后，可特异性地封闭致病性抗体与乙酰胆碱受体的结合位点，从而对乙酰胆碱受体起到保护作用[2].本实验室曾制备了人源性抗乙酰胆碱受体主要免疫原区的单链抗体ScFv637[3]，为了克服ScFv637半衰期短的缺点，又将其与人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）相连，构建了ScFv637?HSA融合基因[4].为提高融合蛋白的表达质量，选择了真核表达系统.

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  菌种与质粒  大肠杆菌DH5α由荷兰马斯特里赫特大学医学院神经系神经免疫学实验室提供，质粒pPIC9K及毕赤酵母菌GS115由军事医学院输血研究所章金刚教授惠赠.

    1.1.2  试剂  限制性核酸内切酶SnaB Ⅰ，EcoR Ⅰ和T4DNA连接酶为美国NEB公司产品；SalⅠ为大连TAKARA公司产品；High Fidelity PCR System?5Kb，氨苄青霉素及其他化学试剂均为华美生物工程公司产品；Wizard Plus Minipreps/Midipreps DNA Purification System为美国Promega公司产品；TAKARA DNA A?Tailing Kit，TAKARA DNA Ligation Kit和pMD18?T Simple Vector均为大连TAKARA公司产品.

    1.1.3  引物合成  根据原核表达载体pHEN2?ScFv637?HSA[4]中ScFv637前10位氨基酸序列设计5′引物，再根据c?myc后10位氨基酸互补核苷酸序列设计3′引物，VH 5′引物为GACTTACGTAGAGGTGCAGCTGCTGGAG，c?myc 3′引物为CGGAATTCATTCAGATCCTCTTCTGAGATG，其中画线部分分别引入了SnaBⅠ和EcoRⅠ限制性酶切位点，引物由大连TAKARA公司合成.

    1.2  方法

    1.2.1  PCR扩增ScFv637?HSA基因  在50μL反应体系中依次加入无菌去离子水37.5μL，20×PCR反应缓冲液（氯化镁?Free）2.5μL，氯化镁3μL，4×dNTP1μL，VH 5′引物（10μmol/L）1.5μL，c?myc3′引物（10μmol/L）1.5μL，模板DNA（pHEN2?ScFv637?HSA, 0.57g/L）1μL，Taq DNA 聚合酶1μL (1U)，Pfu DNA聚合酶1μL（1U）.反应条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共进行30次循环，其后72℃延伸5min.取5μL反应产物行琼脂糖凝胶电泳.

    1.2.2  PCR产物加“A”处理及TA克隆  按Wizard PCR Preps DNA Purification System试剂盒说明书对扩增产物进行纯化，按TAKARA DNA A?Tailing Kit说明书对产物进行加“A”处理，按照TAKARA DNA Ligation Kit试剂盒说明书进行操作，得到ScFv637?HSA?T Vector.连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆扩增后测定序列，证实其结果准确.

    1.2.3  ScFv637?HSA与pPIC9K连接  采用SnaBⅠ和EcoRⅠ对ScFv637?HSA?T Vector和pPIC9K进行双酶切，回收酶切产物切胶，用T4DNA连接酶进行连接，并将连接后的pPIC9K?ScFv637?HSA转化至感受态大肠杆菌DH5α，进行克隆.

    1.2.4  重组载体的酵母转化  制备毕赤酵母GS115感受态及用于电转化的DNA样品，转化条件为：电压为1.5kV，电容为25μF，电阻为200Ω，转化时间随DNA样品的不同而变化，并由仪器自动给出，通常在3.5～4.0ms范围内.电转后行单菌落PCR筛选阳性转化子.

    2  结果

    将目的基因转化至毕赤酵母GS115后，应用扩增目的片段时使用的引物进行PCR筛菌.电泳结果可发现，GS115（pPIC9K?ScFv637?HSA）扩增出相对分子质量为2.6kbp的目的条带，表明pPIC9K?ScFv637?HSA已准确整合到GS115菌株染色体中（Fig1）.

    3  讨论

    在PCR扩增过程中，除了使用Taq DNA聚合酶以外，还应用了Pfu DNA聚合酶，该酶具有3′→5′外切校正活性，可提高PCR反应的保真性.Taq DNA聚合酶催化形成产物的3′末端通常有1个非模板依赖的dA[5]，T载体的末端有1个悬挂的dT，刚好可与PCR产物末端的dA配对.但使用了Pfu DNA聚合酶后，该酶会将PCR产物3′末端的“A”切除，故在TA克隆前要先对PCR产物进行末端加“A”处理.在毕赤酵母系统中的表达载体不含酵母复制起始点，导入酵母体内的重组表达载体只有整合到酵母染色体上，外源基因才可稳定存在，外源蛋白稳定表达，整合的转化子一旦形成就非常稳定.转化后的重组表达载体若未能整合到染色体上，而以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组载体极易丢失.因此重组载体必须整合入酵母基因组DNA中才能实现外源基因的稳定及高表达.Wetterholm等［6］利用毕赤酵母表达系统进行蛋白表达，纯化后蛋白得率为0.5～1.0mg/L，为了得到高表达的蛋白，本实验选择了该系统.毕赤酵母的转化常使用原生质球法和电穿孔法，二者转化率均较高，一般可得到高拷贝重组，其转化效率均可达到105/μg，但原生质球法操作繁琐费时，而电穿孔法简便、快速及高效，是目前效率较高的DNA转化方法.制备用于电转化的GS115感受态细胞时，其OD600应控制1.3～1.5间，让细胞至少完成2次分裂，在细胞的第3,4次分裂期间转化效率较高且相对恒定.从酵母菌落获取模板进行PCR是快速可行的分析酵母基因组的方法[7]，而用酸洗玻璃珠通过物理机械作用破坏细胞，使核酸释放，再用经典的核酸纯化方法即酚?氯仿抽提及乙醇沉淀的方法，可获得较好的提取效果.此种方法制备模板行PCR时，结果受模板浓度的影响小，实验结果较稳定.本实验用PCR方法扩增了融合蛋白ScFv637?HSA基因，克隆到中间载体后，经过酶切及连接后亚克隆至真核表达载体pPIC9K，提高了外源基因的表达质量，为后续的蛋白功能检测奠定了基础.

【】
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