尾加压素Ⅱ促进肾系膜细胞增殖的细胞内机制研究

【摘要】  目的：研究尾加压素Ⅱ(UⅡ)对肾系膜细胞(GMC)增殖功能的影响以及细胞内信号转导机制。方法：①采用［3H］_胸腺嘧啶(3H_TdR)掺入实验研究UⅡ对GMC增殖的影响。②加入不同的细胞内信号转导阻断剂，观察UⅡ作用的信号转导通路。结果：UⅡ以浓度［(10-9～10-7)mol/L］依赖的方式促进GMC　3H_TdR掺入，分别较对照组高86.9%、105.8%和134.2%(P<0.01)。UⅡ刺激 3H_TdR掺入的效应能够被L_钙通道阻断剂尼卡地平、钙调素激酶(CaM_PK)阻断剂W7和蛋白激酶C(PKC)阻断剂H7所抑制，抑制率分别为42.3%、49.3%和34.1%(P<0.01)。丝裂素活化蛋白激酶阻断剂PD98059虽能轻度抑制UⅡ效应，但无统计学意义(P>0.05)。结论：UⅡ明显促进GMC增殖，该效应与胞外Ca2+内流、CaM_PK以及PKC有关，并提示UⅡ可能在肾纤维化发生和过程中发挥着重要作用。

【关键词】  肾系膜细胞 增殖 尾加压素 信号转导

　　Mechanisms of Proliferation Effect of Urotensin Ⅱ on Glomerular Mesangial Cells of Rats

　　ZHANG Yong_gang，WEI Rui_hong，LI Yu_guang，PANG Yong_zheng，TANG Chao_shu

　　(Department of Cardiovascular Diseases, The First Affiliated Hospital, Shantou University Medical College, Shantou  515041, China；Department of internal medicine, The Second Affiliated Hospital, Shantou University Medical College, Shantou  515041, China；Institute of Cardiovascular Research, Peking University First Hospital, Beijing  100034, China)

　　［Abstract］Objective: To investigate the proliferation effect of urotensin Ⅱ(UⅡ)on glomerular mesangial cells (GMC)of rats，and to study the signal transduction pathways.  Methods: GMC proliferation was examined by the increase in 3H_thymidine(3H_TdR)incorporation into DNA.  Different inhibitors were used to study the signal transduction pathways involved in the effect of UⅡ.  Results: UⅡ［(10-9～10-7)mol/L］induced 3H_TdR incorporation in a concentration_dependent manner, which was increased by 86.9%, 105.8% and 134.2%(P<0.01)in 10-9, 10-8 and 10-7 mol/L groups, respectively, compared with the control group.   The Ca2+ channel blocker nicardipine(10-5mol/L), protein kinase C(PKC)inhibitor H7(10-5mol/L)and CaM_PK inhibitor W7(10-5mol/L)significantly inhibited the effect of UⅡ, which was decreased by 42.3%、49.3%和34.1%(P<0.01), compared with the UⅡ group(10-8mol/L). Howe_ver, PD98059(10-5mol/L), an inhibitor of mitogen_activated protein kinase, couldn?t inhibit the effect.  Conclusion:  UⅡ can stimulate GMC proliferation, through Ca2+, PKC and CaM_PK signal transduction pathways, and may play important roles in the development of renal fibrosis．

　　［Key Words］glomerular mesangial cell;  proliferation;  urotensin Ⅱ;  signal transduction

　　尾加压素Ⅱ(UrotensinⅡ,UⅡ)是一种近年在哺乳动物体内发现的强力缩血管活性肽［1，2］，它及其受体GPR14主要分布在神经系统［3］、心血管系统［2］和肾脏组织［4～6］。研究表明，UⅡ在高血压、再狭窄、心力衰竭等心血管疾病、肾脏疾病以及糖尿病等疾病过程中发挥重要作用［7～12］。除缩血管活性外，UⅡ还是一种强烈的丝裂原，能够促进血管平滑肌细胞、内皮细胞、心肌成纤维细胞增殖，从而通过促丝裂作用加速疾病的发生和发展［13～15］。然而，UⅡ在肾脏疾病中的病理、生理作用及其机制尚不明确。为此，我们在体外培养的大鼠肾系膜细胞(Glomerular　mesangial　cells，GMC)上探讨UⅡ刺激细胞增殖的作用及其细胞内机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料
   
　　SD大鼠由北京大学医学部实验动物部提供()，大鼠UⅡ(纯度>99.5%)为Phoenix Pharm Inc产品(美国)。RPMI 1640培养基、钙通道阻断剂尼卡地平(NI)、蛋白激酶C(PKC)抑制剂H7、钙调素激酶阻断剂W7以及丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)阻滞剂PD98059为Sigma公司(美国)产品，3H_胸腺嘧啶(3H_TdR)为Amersham　Pharmacia　Biotech公司(德国)产品，余为市售分析纯试剂。

　　1.2  方法

　　1.2.1  大鼠肾小球分离和GMC培养  见［16］。

　　1.2.2  3H_TdR掺入实验［13］  将培养的细胞用1.25g/L胰酶消化并制成细胞悬液，以2×104/孔接种于24孔板，贴壁培养24h后，换为乏血清培养(体积分数1%血清)24h，使细胞处于G0期，加入不同浓度的UⅡ培养12h，然后加入3H_TdR(37kBq/孔)继续培养12h，用Millipore抽滤，收集于玻璃纤维膜上，用体积分数10%高氯酸破碎细胞，PBS冲洗，滤膜干燥后加入闪烁剂(PPO/POPOP/二甲苯/无水乙醇)，用液闪仪(Beckman公司，德国)检测3H放射性强度，结果以cpm表示。

　　1.2.3  实验分组  以不同浓度UⅡ对GMC 3H_TdR掺入的影响分为①对照组，②UⅡ_1组(10-10mol/L)，③UⅡ_2组(10-9mol/L),④UⅡ_3组(10-8mol/L),⑤UⅡ_4组(10-7mol/L)。以不同信号途径阻断剂对UⅡ效应的影响分为①对照组(不加任何处理因素)，②UⅡ组(只加UⅡ，浓度10-8mol/L，下同)，③UⅡ+NI(10-5mol/L)组，④UⅡ+H7(10-6mol/L)组，⑤UⅡ+W7(10-6mol/L)组，⑥UⅡ+PD98059(10-5mol/L)组。

　　1.2.4  统计学处理  数据以±s表示，用方差分析组间q检验。

　　2  结果

　　2.1  UⅡ对GMC 3H_TdR掺入的影响
   
　　UⅡ以浓度［(10-9～10-7)mol/L］依赖性方式促进GMC 3H_TdR掺入，以UⅡ_4组刺激作用尤为明显。UⅡ 2～4组3H_TdR掺入量分别较对照组高86.9%，105.8%和134.2%(P<0.01)。而UⅡ_1组掺入量与对照组比无统计学意义(P>0.05，表1)。

　　表1  UⅡ对GMC 3H_TdR掺入的影响（略）

　　Table 1  Effect of UⅡ on 3H_TdR incorporation into GMC of rats

　　与对照组比  1)P<0.01

　　2.2  不同信号转导阻断剂对UⅡ作用的影响
   
　　UⅡ组3H_TdR掺入量较对照组高92.4％(P<0.01)。Ni、H7以及W7能明显抑制UⅡ　3H_TdR掺入，其抑制率分别为42.3%、49.3%和34.1%(P<0.01)，PD98059不能够明显影响UⅡ的作用(P>0.05，表2)。

　　表2  细胞内信号转导阻断剂对UⅡ刺激GMC 3H_TdR掺入的影响（略）

　　Table 2  Effects of different signal transduction inhibitors on proli_feration of rats GMC induced by UⅡ
　
　　与对照组比  1)P<0.01；与UⅡ组比  2)P<0.01

　　3  讨论
   
　　UⅡ是继ET_1之后发现的又一新的缩血管活性肽，它能够收缩哺乳动物的大中动脉血管、气道和肠道平滑肌，收缩离体心肌组织，并有促丝裂作用，能刺激血管内皮细胞、平滑肌细胞、气道平滑肌细胞以及肿瘤细胞增殖，诱导心肌细胞肥大［9］。我们曾在离体孵育的大鼠主动脉组织上发现，UⅡ能以剂量依赖性方式激活NO合酶，尤其是血管固有型NO合酶，增加血管NO生成，促进血管外膜精氨酸转运［17,18］。我们曾报道慢性缺氧致肺动脉高压大鼠心肌UⅡ含量以及UⅡ受体结合位点明显升高［19］，最近发现UⅡ能够协同异丙肾上腺素所致心肌肥大和心肌纤维化过程［20］。有学者报道肾功能衰竭患者和糖尿病肾功能衰竭患者UⅡ表达明显升高［21］，提示UⅡ可能在肾脏功能稳态调节以及疾病发生中发挥重要作用，然而其作用机制尚不完全清楚。

   
　　本研究在体外培养的GMC上，采用3H_TdR掺入法，发现UⅡ能够以浓度依赖的方式促进细胞3H_TdR掺入增加，促进细胞增殖。该作用能够分别被Ca2+通道阻断剂NI、钙调素激酶阻断剂W7以及PKC抑制剂H7所阻断，提示凡影响胞浆Ca2+水平上的信号转导途径，即L_钙通道、CaM_PK以及PKC都能够影响对GMC的促增殖效应。然而，PD98059不影响UⅡ的效应，提示受体酪氨酸激酶_MAPK细胞增殖途径可能不是UⅡ促GMC增殖的主要途径。UⅡ的病理、生理意义及其作用机制是近年的研究热点之一。我们在国内首先报道了UⅡ的促丝裂效应。在培养的血管平滑肌细胞上，发现UⅡ能够促进细胞增殖，该作用需通过Ca2+、PKC、CaM_PK以及MAPK来实现［13］。我们还发现UⅡ能够促进新生乳鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原分泌，其增殖效应与细胞外Ca2+内流、CaM_PK以及PKC激活有关，而促胶原合成作用可能通过其它途径来实现［22］。在慢性缺血所致肺动脉高压右心肥大大鼠上，我们发现右心室UⅡ以及受体结合位点明显上调，而血浆UⅡ水平并无明显变化，提出UⅡ可能主要以自分泌和旁分泌作用方式发挥效应这一观点［19］。上述结果进一步被其他学者所证实［4,9］。最近我们还发现UⅡ能够通过Ca2+、PKC以及MAPK途径刺激大鼠主动脉组织合成和释放内皮素_1［23］。一系列研究表明，UⅡ可通过GPR14受体、Ca2+、c_Src、PKC、MAPK和ROCK途径参与平滑肌细胞增殖以及促进巨噬细胞向泡沫细胞转化［9］，并且MAPK途径激活还参与了UⅡ促进内皮细胞增殖的过程［14］。而本研究则证实UⅡ还能够通过激活L_钙通道、钙调素以及PKC途径刺激GMC的增殖。这与UⅡ促进心肌成纤维细胞的作用机制相近，但仍有待于进一步研究。
   
　　GMC是肾小球固有细胞，正常情况下GMC生长和分裂速度都很慢。但在病理情况下，生长和抑制失衡，GMC增殖活跃，产生大量细胞外基质，最终导致肾小球硬化和肾纤维化、肾功能进行性下降。许多因素能够促进GMC活化，使之发生表型转化并异常增殖，分泌细胞外基质和活性因子、炎性介质等，促使病变的发生和。本研究发现UⅡ能够促进GMC增殖，提示UⅡ可能在肾小球炎症与硬化等疾病的发病过程中发挥重要作用。

【】
  　　［1］Coulouarn Y, Lihrmann I, Jegou S, et al. Cloning of the cDNA encoding the urotensin Ⅱ precursor in frog and human reveals intense expression of the urotensin Ⅱ gene in motoneurons of the spinal cord［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95 (26):15 803-15 808.

　　［2］Ames RS, Sarau HM, Chambers JK, et al. Human urotensin_Ⅱ is a potent vasoconstrictor and agonist for the orphan receptor GPR14［J］. Nature, 1999, 401(6 750): 282-286.

　　［3］Spinazzi R, Albertin G, Nico B, et al. Urotensin_Ⅱ and its receptor(UT_R)are expressed in rat brain endothelial cells, and urotensin_Ⅱ via UT_R stimulates angiogenesis in vivo and in vitro［J］. Int J Mol Med, 2006(6): 1 107-1 112.

　　［4］Watanabe T, Suguro T, Kanome T, et al. Human urotensin Ⅱ accelerates foam cell formation in human monocyte_derived macrophages［J］. Hypertension, 2005, 46(4): 738-744.

　　［5］Song W, Abdel_Razik AE, Lu W, et al. Urotensin Ⅱ and renal function in the rat［J］. Kidney Int, 2006, 69(8):1 360-1 368.

　　［6］Disa J, Floyd LE, Edwards RM, et al. Identification and characterization of binding sites for human urotensin_Ⅱ in Sprague_Dawley rat renal medulla using quantitative receptor autoradiography［J］. Peptides, 2006, 27(6): 1 532-1 537.

　　［7］Clozel M, Hess P, Qiu C, et al. The urotensin_Ⅱ receptor antagonist palosuran improves pancreatic and renal function in diabetic rats［J］. J Pharmacol Exp Ther, 2006, 316(3):1 115-1 121.

　　［8］Langham RG, Kelly DJ, Gow RM, et al. Increased expression of urotensin Ⅱ and urotensin Ⅱ receptor in human diabetic nephropathy［J］. Am J Kidney Dis, 2004, 44(5): 826-831.

　　［9］Watanabe T, Kanome T, Miyazaki A, et al. Human urotensin Ⅱ as a link between hypertension and coronary artery disease［J］. Hypertens Res, 2006,29(6): 375-387.

　　［10］Rakowski E, Hassan GS, Dhanak D, et al . A role for urotensin Ⅱ in restenosis following balloon angioplasty: use of a selective UT receptor blocker［J］. J Mol Cell Cardiol, 2005, 39(5): 785-791.

　　［11］Bousette N, Pottinger J, Ramli W, et al. Urotensin_Ⅱ receptor blockade with SB_611812 attenuates cardiac remodeling in experimental ischemic heart disease［J］. Peptides, 2006,27(11): 2 919-2 926.

　　［12］Gruson D, Rousseau MF, Ahn SA, et al. Circulating urotensin Ⅱ levels in moderate to severe congestive heart fai_lure: its relations with myocardial function and well established neurohormonal markers［J］. Peptides, 2006,27 (6): 1 527-1 531.

　　［13］张勇刚， 齐永芬， 夏春芳， 等. 尾加压素Ⅱ对血管平滑肌细胞增殖的影响［J］. 药通报， 2001， 17(2)： 155-157.

　　［14］Shi L, Ding W, Li D, et al. Proliferation and anti_apoptotic effects of human urotensin Ⅱ on human endothelial cells［J］. Atherosclerosis, 2006, 188(2): 260-264.

　　［15］Johns DG, Ao Z, Naselsky D, et al. Urotensin_Ⅱ_mediated cardiomyocyte hypertrophy: effect of receptor antagonism and role of inflammatory mediators［J］. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2004, 370(4): 238-250.

　　［16］Meger_Lehnert H, Tsai P, Caramelo C. ANF inhibites vasopressin induced Ca2+ mobilization and contraction in glome_ruler mesangial cells［J］. Am J Physio, 1988, 255, F771.

　　［17］姜志胜， 张勇刚， 齐永芬, 等. 尾加压素Ⅱ对大鼠主动脉一氧化氮合酶/ 一氧化氮系统的影响［J］. 北京大学学报(医学版)， 2001， 33(2): 147-149.

　　［18］Lin L, Ding WH, Jiang W, et al. Urotensin_Ⅱ activates L_arginine/nitric oxide pathway in isolated rat aortic adventitia［J］. Peptides, 2004，25(11): 1 977-1 984.

　　［19］Zhang YG, Li JX, Cao J, et al. Effect of chronic hypoxia on contents of urotensin Ⅱ and its functional receptors in rat myocardium［J］. Heart Vessels, 2002,16(2): 64-68.

　　［20］Zhang YG, Li YG, Liu BG, et al. Urotensin Ⅱ accelerates cardiac fibrosis and hypertrophy of rats induced by isoproterenol［J］. Acta Pharmacol Sin, 2007, 28(1): 36-43.

　　［21］Totsune K, Takahashi K, Arihara Z, et al. Elevated plasma levels of immunoreactive urotensin Ⅱ and its increased urinary excretion in patients with Type 2 diabetes mellitus: association with progress of diabetic nephropathy［J］. Peptides, 2004 , 25(10): 1 809-1 814.

　　［22］张勇刚， 陈静炯， 许松. 尾加压素Ⅱ对大鼠心肌成纤维细胞增生和胶原合成的影响及其作用机制［J］. 中华老年心脑血管病杂志， 2001， 3(增刊)： 41-43.

　　［23］张勇刚， 魏睿宏， 张?辉， 等. 尾加压素Ⅱ促进大鼠主动脉合成和分泌内皮素1的机制研究［J］. 中国动脉硬化杂志， 2007, 15(3)： 165-168.