钙拮抗剂对大鼠心肌缺血再灌注早期生长反应基因-1表达的影响

                    作者：李海青，石刚刚，高分飞，贾强用

【摘要】  目的：研究钙拮抗剂(维拉帕米、地尔硫芭卓和硝苯地平)对大鼠心肌缺血再灌注(I/R)芭卓早期生长反应基因-1(Egr-1)表达的影响。方法：大鼠随机分为假手术组、I/R组、二甲基亚砜组、维拉帕米组、地尔硫芭卓组、硝苯地平组。Western blot法测定Egr-1蛋白表达水平的变化；RT-PCR法测定Egr-1 mRNA表达水平的变化。结果：与假手术组比，I/R组Egr-1蛋白及Egr-1 mRNA表达显著增高(P<0.05)；与I/R组比，维拉帕米组、地尔硫芭卓组和硝苯地平组Egr-1蛋白及Egr-1 mRNA表达明显减少(P<0.05)。结论：维拉帕米、地尔硫芭卓和硝苯地平均可抑制缺血再灌注心肌Egr-1蛋白及Egr-1 mRNA的过度表达。

【关键词】  钙拮抗剂；缺血再灌注；早期生长反应基因-1

　　［Abstract］Objective: To study the effects of calcium antagonist(verapamil、diltiazem and nifedipine)on early growth response gene-1(Egr-1)expression in rats after myocardial ischemia-reperfusion(I/R). Methods: Rats were randomly assigned into Sham、I/R、DMSO、verapamil、diltiazem、nifedipine groups. The expression levels of Egr-1 protein and mRNA were examined by Western blot and RT-PCR, respectively. Results: Compared with sham group, Egr-1 protein and mRNA of I/R group overexpressed(P<0.05). The expression levels of Egr-1 of verapamil、diltiazem、nifedipine groups significantly decreased, compared with I/R group(P<0.05). Conclusion: Verapamil、diltiazem and nifedipine can inhibit the overexpression of Egr-1 protein and mRNA in  rats caused by I/R.

　　［Key Words］calcium atagonist; ischemia-reperfusion; early growth response gene-1

    细胞内钙超载是缺血再灌注(I/R)损伤的主要病理机制之一，而作为构成I/R损伤分子通路共同分子基础的核内转录因子——Egr-1［1］，其与细胞内Ca2+之间存在非常紧密的联系，Ca2+可通过不同的信号转导途径直接或间接影响Egr-1的表达。众所周知，钙拮抗剂防治心肌I/R损伤的主要机制是阻断心肌细胞膜钙通道，降低细胞内钙离子浓度［(Ca2+)i］，拮抗钙超载。而我们的前期工作也证实了F2和维拉帕米均能通过阻断心肌细胞膜钙通道，降低心肌细胞(Ca2+)i，防止钙超载拮抗心肌I/R Egr-1的异常表达［2,3］。因此我们提出假设：具有钙拮抗作用的化合物均有抑制Egr-1高表达的效应。为了验证这一假设，进一步探讨钙拮抗剂的共性作用，本实验通过建立大鼠心肌I/R损伤模型，运用3种经典的钙拮抗剂，观察其对Egr-1 mRNA及Egr-1蛋白表达的影响，为进一步探讨其分子生物学机制提供有力的依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物

    SD大鼠｛广州第一军医大学动物中心提供［许可证号：SCXK(粤)2006-0015,2006B008；SPF］｝雌雄不拘，体质量250～350g。

　　1.2  仪器与试剂

    BL-420E信号记录分析系统(四川成都泰盟科技有限公司，)；低温高速离心机(Eppendorf公司，德国)；乳化分析仪(IKA公司，德国)；聚丙烯酰胺凝胶电泳相关仪器、凝胶成像分析系统、转印系统、紫外分光光度计、全自动PCR扩增仪(Bio-RAD公司，美国)；压力蒸汽灭菌器(嘉兴市中新医疗仪器有限公司，中国)；电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂，中国)；二甲基亚砜(DMSO，上海凌峰化学试剂有限公司，中国)；兔抗大鼠Egr-1多克隆抗体(Santa Crutz公司，美国)；HRP标记的山羊抗兔IgG、小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体、HRP标记2抗IgG(博士德公司,中国)；硝酸纤维素膜、Trizol试剂、PCR扩增反应试剂盒(Invitrogen公司,美国)；Egr-1引物和β-actin引物(上海华美生物工程公司，中国)；第一链cDNA合成试剂盒(MBI Fermentas公司,立陶宛)；维拉帕米(恒瑞医药股份有限公司，中国)；硝苯地平和地尔硫芭卓(Sigma公司，美国)。

　　1.3  心肌I/R模型的建立及分组

    大鼠称重,乌拉坦(1.0g/kg)腹腔麻醉，分离气管后立即行正压人工呼吸(频率60次/min，流量2mL/100g)。从左侧第3、4肋间打开胸腔，暴露心脏，剪破心包膜，用2个小拉钩撑开并向下按压胸廓使心脏暴露于胸腔外，在肺动脉圆锥左缘平左心耳下缘2mm冠状动脉处进针，用5/0丝线穿过心肌层。结扎冠状动脉时连同直径2mm的塑料胶管一起结扎造成心肌缺血60min，然后解除结扎再灌注180min。

    大鼠随机分为I/R组(术前5min予NS 1mL/kg，结扎大鼠冠状动脉前降支，60min后松开结扎线，恢复血流，再灌注180min)；DMSO组(术前5min改NS为DMSO，手术操作同I/R组)；维拉帕米组(术前5min予维拉帕米0.5mg/kg,用NS稀释，同样按照1mL/kg给予)；地尔硫芭卓组(术前5min予地尔硫芭卓0.8mg/kg,用NS稀释成1mL/kg给予)；硝苯地平组(术前5min予硝苯地平0.2mg/kg，用NS稀释成1mL/kg给予)；假手术组(术前5min予NS 1mL/kg，手术时冠状动脉前降支穿线但不结扎，持续观察240min)。

　　1.4  Egr-1蛋白测定

    取100mg心肌组织块，用干净的剪刀将组织于冰上快速剪碎，加入预冷的裂解液［20mmol/L Tris·HCl，150mmol/L NaCl，体积分数1％的TritonX-100，1mmol/L乙二胺四乙酸；pH 7.4］1.5mL与5μL的Protease inhibitor cocktail Ⅲ，用乳化分散仪将心肌组织于冰上充分匀浆，每一标本匀浆30s冰上静置30s，共匀浆3次，匀浆至无明显组织颗粒为止，冰上静置10min，2655g，离心10min(4℃)，弃上清液，加入裂解液200μL，冰上静置裂解2h， 期间不断涡旋使其充分裂解， 然后15294g，离心20min(4℃)，吸取部分上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，部分上清液与5×上样缓冲液4∶1混合，煮沸5min。配制分离胶与浓缩胶，然后每一泳道加60μg蛋白样品，电泳(125V，80min)，转膜(350mA，60min)。封闭液封闭1h，加入1∶200 Egr-1抗体稀释液，4℃过夜，洗膜3次，每次10min，加1∶1500的2抗稀释液室温孵育2h，洗膜3次，每次10min，滴1∶1 Ecl化学发光试剂于膜上，反应1min，压片1min，曝光1min，将胶片进行显影、定影。

　　1.5  Egr-1 mRNA的测定

    取-30℃冰箱保存的100mg心肌组织块，转移到5mL离心管中，每管加入1mL Trizol试剂，用干净的剪刀将组织于冰上快速剪碎，用乳化分散仪将心肌组织于冰上充分匀浆，每一标本匀浆30s冰上静置30s，共匀浆3次，匀浆至无明显组织颗粒为止。然后转移至2mL离心管中，室温静置5min，每管加氯仿0.3mL，振摇15s，室温静置3min，10621g,离心10min(4℃)，吸取上层水相，移至另一新的离心管中，加预冷的等体积异丙醇，-30℃冰箱中静置30min，15294g,离心10min(4℃)，弃上清液，加体积分数75%的乙醇1mL，摇振，充分洗涤沉淀，7600g,离心5min(4℃)，弃上清液，超净台中干燥2min，沉淀重悬于RNase-free水中，紫外分光光度计测定RNA浓度及A260/A280比值。提取的总RNA冻存于-70℃冰箱。采用第一链cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA。采用PCR扩增反应试剂盒合成DNA。Egr-1引物(512bp)：上游5′-GCAACACTTTGTGGCCTGAA-3′，下游5′-GAGTTGGGACTGGTAGGTGT-3′；β-actin引物(380bp)：上游5′-GTGGGTATGGGTCAGAAGGA-3′，下游5′-AGCGCGTAACCCTCATAGAT-3′。PCR产物经质量分数1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像分析系统进行拍照和图像分析。

　　1.6  统计学处理

    所有计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析进行组间比较。

　　2  结果

　　2.1  钙拮抗剂对I/R心肌Egs-1蛋白水平的影响

    各组均以Egr-1灰度与β-actin灰度比值进行比较。以I/R组的灰度值为100％，则假手术组、DMSO组、维拉帕米组、地尔硫芭卓组、硝苯地平组灰度值分别为(21.5±4.8)%,(99.6±9.9)%，(46.4±7.6)%,(54.4±7.7)%和(69.4±13.5)%。其中，与假手术组比，I/R组和DMSO组Egr-1蛋白表达显著增高(P<0.05)；DMSO组与I/R组比无统计学意义；与I/R组比，维拉帕米组、地尔硫芭卓组及硝苯地平组Egr-1蛋白表达明显减少(P<0.05，图1)。

　　2.2  钙拮抗剂对I/R心肌Egr-1 mRNA水平的影响

    以Egr-1和β-actin光密度值的百分比来反映各组Egr-1 mRNA的转录水平。以I/R组的灰度值为100％，则假手术组、DMSO组、维拉帕米组、地尔硫芭卓组、硝苯地平组灰度值分别为(14.0±2.6)%,(99.1±10.9)%，(51.5±9.6)%,(57.5±10.9)%和(70.9±9.0)%。其中，与假手术组比，I/R组和DMSO组Egr-1蛋白表达显著增高(P<0.05)；DMSO组与I/R组比无统计学意义(P>0.05)；与I/R组比，维拉帕米组、地尔硫芭卓组及硝苯地平组Egr-1蛋白表达明显减少(P<0.05,图2)。

　　3  讨论
   
　　研究表明，心肌I/R损伤的发生与细胞内、外Ca2+分布的破坏即钙超载密切相关。钙拮抗剂通过阻断心肌细胞膜钙通道，降低细胞(Ca2+)i拮抗钙超载心肌I/R损伤已成为目前的一种共识［4,5］。
   
　　Egr-1属于即刻早期基因家族，多种刺激因素(缺血、缺氧等)均可诱导其快速表达。Egr-1早期被认为与细胞的生长分化及肿瘤发生密切相关。除此之外，Egr-1还参与了多种病理生理过程，是多种细胞外环境的刺激信号与靶基因表达之间的耦联分子［6,7］。Yan等［1］采用反义寡核苷酸(AS-ODN)技术证实，在未经Egr-1 AS-ODN处理的肺组织，I/R过程中，Egr-1表达上调，而异常表达的Egr-1又起着“分子开关”的作用，通过诱导一系列下游基因的表达，最终引起炎症反应、凝血和血管通透性这三大I/R病理损害。本实验的结果也证实，I/R组的Egr-1蛋白和Egr-1　mRNA的表达水平较假手术组明显升高，提示Egr-1在I/R病理过程中发挥着非常重要的作用。

    Ca2+是细胞信号转导过程中最常见的第二信使，细胞(Ca2+)i升高可通过多条途径磷酸化Ca2+敏感的基因转录序列，进而调节靶基因的表达。研究表明，Ca2+可通过磷酸激酶C诱导牛冠状动脉内皮细胞及心肌细胞Egr-1的表达［8］，另外Ca2+也可通过MAPK、Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶等途径调节Egr-1表达［9,10］。以上事实说明Ca2+与Egr-1表达存在一定的联系：Ca2+可通过不同机制直接或间接影响Egr-1转录表达，进而共同调节细胞的生长、增殖和分化。本课题组前期研究证实能够阻断心肌细胞膜钙通道的F2及作为阳性对照药的维拉帕米可以抑制心肌I/R所致的Egr-1蛋白和Egr-1　mRNA的异常表达［2］。本实验结果亦显示，维拉帕米、地尔硫芭卓和硝苯地平均能抑制I/R所致的心肌组织Egr-1蛋白和Egr-1　mRNA的异常表达，由此我们有理由认为，降低细胞(Ca2+)i，进而抑制Egr-1的表达，是钙拮抗剂拮抗心肌I/R损伤作用的重要机制之一。

    从本实验可以看出，3种钙拮抗剂对I/R所致的Egr-1异常表达的抑制作用强弱并不完全相同，Egr-1蛋白和Egr-1 mRNA的结果都显示维拉帕米和地尔硫芭卓的作用较强，而硝苯地平的作用较弱，与本课题组前期离体细胞的实验结果相同。这可能与3种药物的选择性作用位点不同有关，维拉帕米和地尔硫芭卓主要作用于心脏，而硝苯地平主要作用于血管。但最终还需通过量效关系才能确定3种药物的作用强弱。本实验以I/R心肌作为模型，初步探讨钙拮抗剂对心肌I/R Egr-1蛋白和Egr-1 mRNA的影响，揭示了钙拮抗剂防治心肌I/R损伤的新机制，对今后进一步探讨其具体分子机制奠定了基础。

【】
  　　［1］Yan SF, Fujita T, Lu J, et al. Egr-1, a master switch coordinating upregulation of divergent gene families underlying ischemic stress［J］. Nature Medicine, 2000, 6: 1 355-1 361.

　　［2］Zhang YM, Shi GG, Zheng JH, et al. The protective effects of N-n-butyl haloperidol iodide on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats by inhibiting Egr-1 overexpression［J］. Cell Physiol Biochem, 2007, 20(5): 639-648.

　　［3］Huang ZQ, Shi GG, Chen CY, et al. Protective effect of quaternary ammonium salt derivative(F2)of haloperidol on iodide on rat myocardial ischemia and reperfusion injury and L-type calcium current［J］. Acta Pharmacol Sin, 2003, 24(8): 757-763.

　　［4］Hoffman JJ, Gilbert TB, Poston RS, et al. Myocardial reperfusion injury: etiology, mechanisms, and therapies［J］. J Extra Corpor Technol, 2004, 36(4): 391-411.

　　［5］Moukarbel GV, Ayoub CM, Abchee AB, et al. Pharmacological therapy for myocardial reperfusion injury［J］. Current Opi-nion in Pharmacology, 2004, 4(2): 147-153.

　　［6］Yan SF, Pinsky DJ, Mackman N, et al. Egr-1: is it always immediate and early［J］. J Clin Invest, 2000,105:553-554.

　　［7］Kaufmann K, Thiel G. Epidermal growth factor and thrombin induced proliferation of immortalized human keratinocytes is coupled to the synthesis of Egr-1, a zinc finger transcriptional regulator［J］. J Cell Biochem, 2002, 85(2): 381-391.

　　［8］Lo LW, Cheng JJ, Chiu JJ, et al. Endothelial exposure to hypoxia induces Egr-1 expression involving PKC-mediated Ras/Raf-1/ERK1/2 pathway［J］. J Cell Physiol, 2001, 188: 304-312.

　　［9］Bernal-mizrachi E, Wice B, Inoue H, et al. Activation of Serum Response Factor in the Depolarization Induction of Egr-1 Transcription in Pancreatic Islet β-Cells［J］. Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(33): 25 681-25 689.

　　［10］Pulver-kaste RA, Barlow CA, Bond J, et al. Ca2+ source-dependent transcription of CRE-containing genes in vascular smooth muscle［J］. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, 2006, 291(1): H97-105.