连接蛋白43磷酸化状态与缝隙连接通道功能的关系

【摘要】  缝隙连接(GJ是介导相邻细胞间直接通讯的特殊膜结构。连接蛋白43(Cx43的磷酸化与去磷酸化对GJ通道的功能有非常重要的影响。激活不同的蛋白激酶可引起Cx43的羧基端21个丝氨酸中的12个残基、6个酪氨基的2个残基(247、265磷酸化；通过点突变方法研究发现,这些特殊部位的磷酸化导致GJ通道功能改变。现就Cx43磷酸化状态与GJ通道功能的关系作一综述。

【关键词】  缝隙连接；连接蛋白43；磷酸化；去磷酸化

　　研究表明，连接蛋白43(Cx43和细胞间隙连接通讯(GJIC在多种心血管疾病的发生、起重要作用。高血糖可以促进Cx43磷酸化，引起缝隙连接(GJ功能的改变。因此，研究Cx43的磷酸化状态改变与心脏GJ功能的关系，对阐明磷酸化对GJ的作用机制，阐明DM患者心律失常的发生机制有重要意义。

    1  GJ的结构

    GJ又称间隙连接、通讯连接,是由连接相邻2个细胞之间的连接通道排列而成的一种特殊膜结构。每个GJ通道由相邻2个细胞各提供1个相同或不同的连接子(亦称为半通道以非共价键对接而成的亲水通道，直径约1.5nm,允许分子质量低于1ku的离子或小分子物质通过,这是GJ执行各种生理功能的结构基础。连接子是由6个相同或不同的亚单位即Cx环绕排列成的中空小管,其外形如棒状,直径6～7nm。

    2  GJ的功能

    相邻细胞间通过GJ所介导的GJIC进行着信息、能量和物质的交换,参与细胞间物质交换的代谢偶联和电信号传递的电偶联,对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起着重要的调控作用。其生理功能主要有①心脏和神经元组织中动作电位的快速传导，其中Cx43单通道电导为60～100ps［1］;②细胞间代谢产物或营养物质和水分子的被动扩散，如核苷酸、ATP、葡萄糖等［2］；③细胞间各种离子或第二信使如Ca2+、三磷酸肌醇及环化核苷酸的交流［3］。

    3  GJ功能的调节

    GJ通道的功能包括介导细胞间电耦联和化学耦联。评价GJ功能的方法主要有膜片钳技术和低分子染料通透试验。Cx43形成的GJ通道允许分子质量小于1000u和/或直径小于1.5nm的离子或小分子通过。由于GJ通道具有口径大、低选择性、开放稳定性及协作的双细胞结构等特点，因此GJ通道一般不被认为是通常意义上的离子通道，而被认为是具有自己独特结构、功能和特性的一种特殊通道。GJ通道的功能受多种因素的影响，这些因素主要有胞内pH值、Ca2+浓度、Cx的磷酸化状态、跨通道电压以及一些神经体液因子。胞内pH值降低可致GJ通道功能减弱甚至关闭，细胞间失去耦联。胞内Ca2+浓度下降时，GJ通道的电导呈剂量依赖性下降，而当胞内Ca2+浓度与pH值同时下降时，则电导下降更为明显［4～6］。

    4  Cx43

    4.1  Cx43的结构

    编码人类Cx43的基因位于6q22.3，全长约3.0kb。Cx基因家族是保守的，不同的Cx具有共同的结构特征。Cx43属于Cxα亚组，分子质量43ku，其蛋白质肽链由382个氨基酸构成，其中氨基酸1～242构成管道部分，243～382为细胞质尾部［7］。从氨基末端(N端至羧基末端(C端共出入细胞膜4次，形成2个胞外环和1个胞内环，4个α螺旋结构的跨膜片段，从N端至C端分别是M1～M4，N端和C端均位于细胞质内。Cx最为保守的区域是2个胞外环，其次是4个跨膜片段，N端保守性次于跨膜片段，亦为保守区域。胞内膨大的C端氨基酸数目和序列区别较大，是不同Cx的主要区别。Cx43的细胞质尾部在不同种属和不同组织间长度稍有变化［8］。另外，Cx的大多数功能调节位点也在C端［9］。

    4.2  Cx43的生命周期

    Cx43在SDS_PAGE上至少表现为P0～2等3条分子质量从40～46ku的区带。有时在P0和P1_Cx之间有1个次要的磷酸化条带P′；在有丝分裂细胞等还可以见到超磷酸化的Cx43条带P3。P0代表刚合成非磷酸化的Cx43，分子质量约40～42ku；P1代表部分磷酸化的Cx43，分子质量约43～44ku；P2代表高度磷酸化的Cx43，分子质量约46ku［10_11］。利用Cx43在电泳凝胶上移动性的改变，是判断其磷酸化较为简单和常用的方法。

    通常情况下，Cx43首先在内质网合成，然后转运至高尔基复合体，最后在细胞膜上聚集形成GJ［12］，但在转运至细胞膜之前，是否有先形成寡聚体则仍不清楚。在应激条件下，GJ单位通过胞吞，被从斑块的中央加速移除，形成环状GJ，与胞吞小体结合，进而被溶酶体降解。Cx处于动态变化过程，Cx43的半衰期约1～3h［13］。较短的半衰期对快速调节通道数量具有重要意义。

    5  GJ通道功能调节与CX43磷酸化状态的关系蛋白质磷酸化作用是真核细胞信号转导中的核心,通常磷酸化作为一个分子开关在不同通路如代谢、信号转导和细胞分裂等控制着蛋白质的活性,蛋白质的磷酸化参与酶的作用机制,以及介导蛋白质的活性。

    CX43的磷酸化与去磷酸化对GJ通道的功能有非常重要的影响［14］,CX43的C端241～382为主要磷酸化区,也是多种激素的识别位点,丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸残基的磷酸化程度决定着GJ通道的通透性及功能,在心肌细胞,CX43的磷酸化使GJ通道开放,去磷酸化使该通道关闭,而且是该通道解聚的关键点,CX43一旦去磷酸化,该通道即开始解聚为Cx亚单位,而Cx亚单位可以进一步解聚或转入细胞内储存，对大多数细胞如平滑肌细胞、肝上皮细胞Cx磷酸化则导致GJIC的中断Cx翻译后经磷酸化而发生结构及功能的改变,磷酸化在Cx的生命周期(如运输、合成、分解、降解以及GJ通道的门控方面起着重要的调控作用。

    5.1  蛋白酪氨酸激酶(PTK

    5.1.1  非受体PTK  c_Src蛋白激酶是正常细胞的酪氨酸特异性蛋白激酶，而其基因轻微改变后表达的v_Src蛋白激酶则是一种致瘤性蛋白激酶。Src通过多种机制影响Cx43通道功能：①作用于蛋白激酶C(PKC、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK等丝氨酸激酶，进而磷酸化Cx43，抑制通道功能；②影响能作用于通道功能的蛋白质的表达；③直接磷酸化Cx43［15］。v_Src直接磷酸化Cx43的Tyr247和Tyr265位点，引起通道关闭，可能与降低通道开放概率有关，而非通过降低单通道传导性［16］。Tyr265位点突变，v_Src则无法磷酸化Cx43，但单纯的Tyr265位点磷酸化并不足以使通道关闭，只有进一步磷酸化Tyr247才使得通道关闭，可能的作用方式：v_Src通过SH3结构域与Cx43富含脯氨酸的274～283区域结合；接着磷酸化Cx43，主要在Tyr265；v_Src的SH2与Cx43 Tyr265对接，增加亲和力并使Src磷酸化Tyr247导致通道关闭［17］。

    5.1.2  受体PTK  表皮生长因子(EGF可引起Cx43的磷酸化，主要作用在Ser残基。EGF激活相应受体的酪氨酸蛋白激酶活性，通过MAPKs引起Cx43S255、S279、S282磷酸化，降低通道开放概率，使通道关闭［18］。血小板衍化生长因子引起的Cx43通道功能中断则不只与Cx43的磷酸化或MAPKs的活化有关，还可能需要另外的信号途径，但具体磷酸化Ser的哪个位点仍不清楚。

    5.2  丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶

    5.2.1  MAPKs  包括ERK1/2、BMK_1(ERK5、p38、JNK等。MAPK可磷酸化Cx43的Ser279和Ser282等位点，引起的GJIC快速短暂性降低［19_20］。

    5.2.2  PKC  在体外，PKC可磷酸化Cx43的Ser372和Ser368位点。PKC的激动剂，如12_O_十四烷酰佛波醋酸酯_13、佛波醇乙酯可增强S262和S368的磷酸化程度，前者的磷酸化使得细胞增生增强，但具体机制未明，后者通过降低单一通道传导性来降低GJ功能［21,10］。高糖可以通过PKC高磷酸化Cx43的Ser368位点从而抑制平滑肌细胞的GJIC［22］。另有报道，高糖通过PKC高磷酸化Cx43，刺激Cx43的降解，从而抑制肾小管内皮细胞的GJIC［23］。EK_VITORIN等［24］研究发现，PKC高磷酸化Cx43的Ser368位点，降低通道的选择通透性，降低GJ功能。

    5.2.3  蛋白激酶A(PKA  Ser364位点的磷酸化对cAMP上调Cx43的组装很关键，该过程由PKA介导，但PKA是否直接磷酸化Cx43的这个位点，还是通过活化其它酶再引起该位点的磷酸化仍不十分清楚［25］。磷酸化的Ser364可能对cAMP引起的GJ装配增加起关键作用，而对基础状态下的GJ装配的作用较为次要［26］。YOGO等［27］发现卵泡刺激素可引起大鼠颗粒细胞Cx43的Ser365、Ser368、Ser369、Ser373等位点的超磷酸化，并证明这些位点的磷酸化由PKA介导，这4个位点的超磷酸化增强了通道的形成及功能。

    5.2.4  蛋白激酶G(PKG  在大鼠心肌细胞中，环磷酸鸟苷可激活PKG，能通过磷酸化Cx43的Ser257，降低单通道传导性,使细胞间传导性和对染料的通透性降低［28］。

    5.2.5  酪蛋白激酶1(CK1  体外CK1，特别是其delta亚型，可直接磷酸化Cx43的Ser325、Ser328或Ser330等位点，调节细胞膜上的Cx43装配形成GJ通道，抑制CK1减少Cx43的磷酸化，伴随Cx43朝向细胞膜的减少［29］。LAMPE等［30］研究提示，Ser325/328/330的磷酸化可影响通道的选择通透性及装配，将Ser325/328/330位点突变为丙氨酸后，通道功能明显下降，表现为染料罗氏黄转移能力降低，该过程由CK1介导，心肌缺血通过降低Cx43的磷酸化程度，降低通道功能。

    5.2.6  细胞分裂周期蛋白激酶2  是一种蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶,对有丝分裂的正确起始有重要作用。其在Cx43的作用靶点可能是Ser255，可磷酸化Cx43的Ser255，或通过激活其他激酶使Cx43磷酸化，使GJ通道转移至细胞内，引起GJIC短暂的降低［31］。

【】
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