氯胺酮对哮喘大鼠机械通气肺损伤的保护作用
作者：金立达，蒋柳明，林丽娜，王万铁
【摘要】 目的:探讨氯胺酮对哮喘大鼠机械通气肺损伤的影响。方法:40只SD大鼠制备慢性哮喘模型后随机分成4组（n=10）：对照组（N组），哮喘大鼠旷置8 h，不行机械通气；机械通气组(A组)，采用容量控制机械通气模式（Vt=10 ml/kg，f=30 次/min）通气8 h；不同剂量氯胺酮干预组(K1、K2组)，机械通气前K1组静脉注射氯胺酮5 mg/kg，K2组静脉注射氯胺酮10 mg/kg，余同A组。实验结束后处死大鼠，测量肺湿干重比（W/D）及支气管肺泡灌洗液（BALF）中蛋白含量、白细胞（WBC）计数、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)及一氧化氮（NO）含量，观察肺组织病理形态学变化。结果:与N组比较，A组、K1组、K2组W/D增加，BALF中蛋白含量、白细胞计数、TNF-α、IL-6、NO含量增高（均P<0.05），病理损伤程度加重；与A组比较，K1组、K2组W/D降低，BALF中蛋白含量、白细胞计数、TNF-α、IL-6、NO含量下降（均P<0.05），病理损伤程度减轻；K2组蛋白含量、白细胞计数低于K1组（均P<0.05），其余指标K1、K2两组间差异无显著性（P>0.05）。结论:氯胺酮可抑制TNF-α、IL-6及NO的释放，从而对哮喘大鼠机械通气所致肺损伤起到保护作用。
【关键词】 氯胺酮；机械通气；肺损伤；哮喘；大鼠
Abstract: Objective:To investigate the effect of ketamine on ventilator-induced lung injury (VILI) in asthmatic rats. Methods: Forty Sprague-Dawley (SD) asthmatic rats were anesthetized, tracheotomized and randomly divided into four groups（n=10）: group N received normal saline iv. but not mechanically ventilation, the other three groups were ventilated for 8 h （Vt=10 ml/kg, f=30 bpm）. Group A received normal saline iv, group K1 received ketamine iv in a bolus of 5 mg/kg and group K2 received ketamine iv in a bolus of 10 mg/kg. The lungs were removed for determination of the wet to dry weight ratio (W/D), TNF-α, IL-6, NO and protein content in bronchoalveolar lavage fluid (BALF). Total white blood cells (WBC) in BALF were counted and lung histopathology were assessed among four groups. Results: The content of TNF-α, IL-6, NO, protein of BALF, together with the value of W/D were significantly higher in group A than that in group N, K1 and K2, while decreased in group K1 and K2 than that in, group A (P<0.05). A large quantity of WBC were found in BALF of group A, while the amount of WBC was decreased in group K1 and K2 than that in group A (P<0.05). Histopathologic findings demonstrated more infiltrating neutrophils and destructive changes of the alveolar wall in group A than that in other groups. The content of protein, the quantity of WBC in BALF were higher in group K1 than that in group K2. Conclusion: Long time ventilation can aggravate lung injury of asthma rats. Ketamine attenuates VILI in asthma rats in part because of probably inhibiting TNF-α, IL-6 and NO content in lung tissues.
Key words: ketamine; ventilation; lung injury; asthma; rat
机械通气所致肺损伤（VILI）是机械通气并发症之一。以往VILI模型多由健康动物制备，而临床上行全麻机械通气或呼吸机支持的患者常伴有哮喘病史，机械通气更容易造成肺损伤[1]。如何更好地防治哮喘患者VILI，成为临床上关注的热点。氯胺酮作为常用的静脉麻醉药，除具有麻醉作用外，还有抗炎、舒张支气管平滑肌、降低气道反应性等作用。氯胺酮对哮喘患者机械通气所致肺损伤的影响，尚未见报道。本研究通过制备哮喘大鼠机械通气肺损伤模型，观察氯胺酮的干预作用，探讨其可能的机制，为临床用药提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料 健康SPF级成年雄性SD大鼠40只，体重300～350 g，由温州医学院实验动物中心提供。盐酸氯胺酮注射液50 mg/ml（福建古田药业有限公司，批号：060809），超声雾化吸入器（PARI BOY N038，德国），卵清蛋白（OVA，sigma公司，美国），氢氧化铝凝胶（自行配制），大鼠TNF-α、IL-6 ELISA检测试剂盒（R&D公司，美国），NO试剂盒（南京建成生物工程研究所），其余试剂均为市售分析纯。
1.2 模型制备和实验分组 大鼠慢性哮喘模型的制备参照谢敏等[2]的方法并稍加改进：第1天和第8天腹腔内注射10%的OVA和10%的氢氧化铝混合液1 ml致敏，第15天开始，予1% OVA雾化吸入激发哮喘，每周3次，每次30 min，连续8周。慢性哮喘大鼠禁食8 h，腹腔注射20%乌拉坦8 ml/kg麻醉，行左股静脉插管用于输液和给药；暴露气管，14号BD留置针行气管插管，接小动物呼吸机行机械通气；呼吸参数设定：频率30次/min，潮气量10 ml/kg，吸呼比（I/E）=1:2，氧浓度（FiO2）:100%。
大鼠随机分成4组，每组10只：①对照组（N组），哮喘大鼠麻醉后行气管插管，旷置8 h，不行机械通气。②机械通气组（A组），采用容量控制机械通气模式通气8 h。③K1组，机械通气前静脉注射氯胺酮5 mg/kg。④K2组，机械通气前静脉注射氯胺酮10 mg/kg。K1、K2组，通气模式同A组,实验期间输液速度维持在5 ml·kg-1·h-1，动物体温维持在37 ℃，8 h后处死大鼠。
1.3 BALF中TNF-α、IL-6、NO、蛋白含量测定及WBC计数 大鼠处死后迅速摘取心肺，4 ℃生理盐水冲洗，将左肺门结扎，用4 ℃生理盐水经气管插管缓慢注入右肺内进行支气管肺泡灌洗，停留30 s后吸出，每次灌洗量为3 ml，反复抽吸，共灌洗3次。4 ℃下3 000 r/min离心10 min，沉淀物用1 ml生理盐水稀释后行WBC计数，取上清液-70 ℃冻存待测。BALF中TNF-α和IL-6含量测定采用双抗体夹心ELISA法，所有操作严格按照试剂盒说明书进行, 先在酶标仪上测量标准品A值并绘制出标准曲线, 然后测量样品A值, 并根据测得的A值在标准曲线上读出样品的浓度。BALF中蛋白含量用考马斯兰法测定，NO含量采用硝酸还原酶法检测。
1.4 肺组织湿干重比（Wet to Dry ratio，W/D）测定 取左肺下部组织用冷生理盐水冲去残血，滤纸吸干水份，在分析天平上精确称湿重后放入80 ℃烤箱中48 h，烘干至恒重后称干重，W/D。
1.5 病改变 取左肺上部组织固定于10%多聚甲醛中，石蜡包埋，切片及HE染色，光镜下观察肺组织病理学改变。
1.6 统计学处理方法 采用SPSS12.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐性者采用LSD法，方差不齐者进行Dunnet's T3检验。
2 结果
2.1 BALF中TNF-α、IL-6、NO、蛋白含量测定及WBC计数 与N组相比，A组、K1组、K2组W/D增加，BALF中TNF-α、IL-6、NO、蛋白含量、WBC计数增高（均P<0.05）；与A组相比，K1组、K2组W/D降低，BALF中TNF-α、IL-6、NO、蛋白含量、白细胞计数降低（均P<0.05）；K2组蛋白含量、白细胞计数低于K1组（均P<0.05），其余指标K1、K2两组间差异无显著性（均P>0.05）（见表1）。
2.2 病改变 N组肺泡结构完整，肺泡内可见少量炎性细胞，肺间质无明显炎性细胞浸润及水肿；A组肺泡壁明显充血、渗出、增厚，肺泡壁及肺间质大量炎性细胞浸润，肺泡结构明显破坏；K1、K2组肺泡结构较清晰，肺泡壁稍增厚，断裂较A组为轻，局灶性肺间质水肿，少量炎性细胞浸润（见图1）。
3 讨论
尽管临床上采用的通气模式在不断改进，机械通气仍是引起肺损伤的风险因素之一。研究发现VILI最后共同途径可能是激活细胞内信号转导通路，活化炎性细胞，产生大量炎症介质，最终导致肺损伤[3]。哮喘的本质是细胞因子参与的慢性气道炎症，部分炎症介质在机械通气过程中介导了各种炎性细胞的活化和炎症介质的释放，形成级联效应，不断放大炎症反应，加重机械通气对肺组织的损伤。本实验制备大鼠慢性哮喘模型，不激发哮喘发作，采用常规的潮气量、较长的通气时间来复制VILI模型，更接近临床实际情况。以BALF中蛋白含量、白细胞计数、肺湿干重比及肺组织形态学变化作为判断肺组织受损程度的指标[4]。A组大鼠经过8 h的机械通气后，BALF中蛋白含量、白细胞计数、肺W/D明显增高，肺组织形态学明显改变，表明哮喘大鼠的VILI模型复制成功。氯胺酮干预能不同程度地抑制上述改变，表现为BALF中蛋白含量、白细胞计数下降，肺W/D降低以及肺组织病理学变化改善，大剂量组效果更为明显，提示氯胺酮可以减轻哮喘大鼠VILI的程度。
TNF-α是引起多种促炎细胞因子和炎症介质失控性释放的关键细胞因子，IL-6与TNF-α共同作用，促进T细胞增殖及多形核中性粒细胞(PMN)的聚集和活化。研究发现TNF-α、IL-6的水平与急性肺损伤的患病率、死亡率直接相关[5]。氯胺酮对TNF-α、IL-1、IL-6等的产生及其效应具有抑制作用[7]，并具有抑制炎症细胞黏附、减少白蛋白外渗并减轻水肿等作用[8]。静脉注射氯胺酮配合机械通气可以有效地控制内科无效的哮喘持续状态及缓解麻醉手术中发生的支气管痉挛[6]。本实验也观察到，A组大鼠BALF中TNF-α、IL-6水平明显升高，提示机械通气后启动了肺组织的炎症反应，促进了炎性因子的释放。氯胺酮干预组大鼠BALF中TNF-α、IL-6水平明显降低，提示氯胺酮可通过抑制炎性因子这一环节发挥抗炎效应，减轻了肺损伤严重程度。
NO由L-精氨酸在血管内皮中的一氧化氮合酶(NOS)作用下生成，与气道感染及气道高反应性有密切关系，是造成组织损伤和炎性反应的重要炎症介质之一[9]。NO在代谢过程中产生大量的毒性氧自由基，导致对肺实质及肺泡的破坏，过量的NO可刺激大量其他炎症介质及炎性细胞因子的释放，加重炎症过程，形成恶性循环。氯胺酮可以通过阻断N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体，减少Ca2+内流，继而抑制iNOS活性，减少NO的合成[10]，这与本实验中观察到的结果相同，可能是其发挥保护作用的机制之一。
【】
[1] Haddad JJ,Safieh-Garabedian B, SaadéNE,et al. Chemioxyexcitation (delta pO2/ROS)-dependent release of IL-1 beta, IL-6 and TNF-alpha: evidence of cytokines as oxygen-sensitive mediators in the alveolar epithelium[J].Cytokine,2001,13(3):138-147.
[2] 谢敏,刘先胜,徐永健,等. 细胞外信号调节激酶1/2信号通路在慢性哮喘模型大鼠支气管平滑肌细胞迁移功能变化中的调控作用[J].生理学报,2007,59(1):94-102.
[3] Ricard JD,Dreyfuss D,Saumon G. Ventilator-induced lung injury[J]. Curr Opin Crit Care,2002,8(1):12-20.
[4] Bellido-Reyes YA,Akamatsu H,Kojima K,et al. Cytosolic phospholipase A2 inhibition attenuates ischemia-reperfusion injury in an isolated rat lung model[J].Transplantation,2006, 81(12):1700-1707.
[5] Parsons PE,Matthay MA,Ware LB,et al. Elevated plasma levels of soluble TNF receptors are associated with morbidity and mortality in patients with acute lung injury[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2005,288(3):L426-431.
[6] Petrillo TM,Fortenberry JD,Linzer JF,et al. Emergency de-partment use of ketamine in pediatric status asthmaticus[J].J Asthma,2001,38(8):657-664.
[7] Lankveld DP,Bull S,Van Dijk P,et al.Ketamine inhibits LPS-induced tumour necrosis factor-alpha and interleukin-6 in an equine macrophage cell line[J].Vet Res,2005,36(2):257-262.
[8] Taniguchi T,Takemoto Y,Kanakura H ,et al. The dose-related effects of ketamine on mortality and cytokine responses to endotoxin-induced shock in rats[J]. Anesth Analg,2003,97(6):1769-1772.
[9] Sittipunt C,Steinberg KP,Ruzinski JT,et al. Nitric oxide and nitrotyrosine in the lungs of patients with acute respiratory distress syndrome[J]. Am J Respir Crit Med,2001,163(2):503-510.
[10] Chen RM,Chen TL,Lin YL,et al. Ketamine reduces nitric oxide biosynthesis in human umbilical vein endothelial cells by down-regulating endothelial nitric oxide synthase expres-sion and intracellular calcium levels[J]. Crit Care Med,2005,33(5):1044-1049.
