中药苦参碱对体外培养人宫颈癌Hela细胞的抑制作用
作者：金畅，滕小玲，雷亚宁，周颖，郑膺，张婵
【摘要】 目的:探讨中药苦参碱对体外培养的人宫颈癌细胞株Hela细胞的抑制作用。方法:选用人宫颈癌Hela细胞进行体外培养，以0.125～2.0 mg/ml的苦参碱分别处理Hela细胞24～72 h后，MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率，透射电镜进行形态学观察，RT-PCR半定量检测凋亡相关基因Bcl-2和Bax的mRNA表达水平。结果:苦参碱对Hela细胞有抑制作用，呈剂量和时间依赖性, 其24 h半数抑制浓度（IC 50）为1.074 mg/ml；流式细胞仪检测到细胞在苦参碱作用后，细胞凋亡率增加；透射电镜观察发现部分细胞发生凋亡早期改变；RT-PCR结果显示凋亡相关基因Bcl-2/Bax比值随药物剂量增加而逐渐减少。结论:苦参碱对人宫颈癌Hela细胞具有明显抑制作用，诱导细胞凋亡可能是其机制之一。
【关键词】 苦参碱；宫颈癌；凋亡
Abstract: Objective:To explore the inhibitory effect of matrine on human cervical carcinoma Hela cells in vitro. Methods: The Hela cells were cultured in vitro and treated with different concentrations(0.125～2.0 mg/ml) of matrine solution for 24～72 hours. MTT assay was performed to evaluate the cytotoxin effect of matrine on Hela cells. FCM was used to detect the apoptosis of Hela cells. Transmission Electron Microscope analyses were carried out to examine the cell morphology. Semiquantitative RT-PCR was assessed to detect the mRNA levels of Bcl-2 and Bax gene expressions. Results: Different concentrations of matrines were cytotoxic to Hela cell in time-dependent and dose-dependent manner. The FCM analysis showed that the apoptosis rate increased after Hela cells were effected by matrine. Partial cells presented characteristic morphological changes under the transmission electron microscope. The results of RT-PCR showed that the rate of Bcl-2/Bax decreased when the matrine concentration increased. Conclusion: Matrine can inhibit the proliferation of human cervical carcinoma Hela cells in vitro. Inducing apoptosis may be one of the mechanisms.
Key words: matrine; cervical carcinoma; apoptosis
苦参碱是从中药苦参（sophora flavescent ait）的干燥根中提取的具有广泛药理作用的活性物质，医学研究表明苦参碱具有抗病毒、抗感染、平喘、增强机体免疫力、升高白细胞、保肝等作用。最近研究表明,苦参碱在体外培养的肝癌、肺癌和白血病中有明显的抗肿瘤作用，且没有化疗药物的毒副作用[1-4]。因此，苦参碱的抗肿瘤作用引起广泛关注，成为研究的热点。但目前苦参碱对宫颈癌抑制作用方面的研究报道较少。本研究选择人宫颈癌Hela细胞，初步探讨苦参碱对体外培养的Hela细胞的抑制作用。
1 材料和方法
1.1 材料 宫颈癌细胞株Hela细胞由温州医学院第一附属科研中心惠赠。胎牛血清、DMEM培养基为Gibco公司产品。四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚枫（DMSO）为美国Sigma公司产品。苦参碱（斯巴特康）注射液为广州明兴药业有限公司产品（批号：060904-2）。Trizol为Invitrogen公司产品。M-MLV逆转录酶和Taq聚合酶及PCR常规试剂为日本Takara公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养：将冻存的宫颈癌Hela细胞37 ℃快速融解，常规复苏和传代。放在含10%胎牛血清的DMEM培养液，37 ℃，5%CO2培养箱内培养。细胞贴壁80%时传代，1周大约2次。
1.2.2 细胞增殖的测定（MTT法）：取对数生长期Hela细胞，以1×104个/孔加入96孔培养皿，过夜贴皿后，加入不同浓度的苦参碱，分别为0.125 mg/ml、0.25 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml，每个浓度设5个复孔，没加药物的细胞作为对照组，另设空白调零孔。分别培养24 h、48 h、72 h后，加入5 mg/ml的MTT 20μl，37 ℃孵育4 h，弃上清，每孔加入200μl DMSO，振荡，使结晶溶解，上机检测570 nm处吸光度A值。细胞生长抑制率=（1-实验组平均A值/对照组平均A值）×100%。实验重复3次，取平均值。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率：Hela细胞按1×105个/ml接种于6皿板，24 h后分别换含0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml苦参碱的培养液，对照组换不含药物的培养液。作用48 h后，用0.05%胰酶-EDTA消化收集各组细胞，PBS洗2次，每次500 r/min离心5 min，去上清后按Annexin V-FITC kit（奥地利Bender MedSystem公司产品）说明书操作，PI和Annexin V双重染色，置BECTON DICKINSON FACSCalibur型流式细胞仪上测定每个样本中的凋亡细胞所占比率。实验重复3次，取平均值。
1.2.4 透射电镜观察苦参碱对Hela细胞超微结构的影响：1.0 mg/ml的苦参碱作用Hela细胞48 h，用细胞刮将细胞刮下，离心，2.5%戊二醛固定，常规电镜标本制作，HITACHI电镜观察细胞超微结构。
1.2.5 RT-PCR半定量检测Bcl-2和Bax基因mRNA表达：细胞按1×105个/ml接种于6皿板，24 h后分别换含0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml苦参碱的培养液，对照组换不含药物的培养液。作用48 h后，用0.05%胰酶-EDTA消化收集各组细胞，Trizol法提取细胞总RNA，每组取2μg总RNA，用M-MLV逆转录酶合成cDNA，PCR扩增Bcl-2和Bax基因，GAPDH为内参基因，各基因引物具体见表1。优化各基因引物PCR条件，30个循环，5μl PCR产物加1μl含溴酚蓝的loading buffer，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，120 V电压，跑胶40 min。用Bio Rab凝胶图像分析仪拍照，Quantity One分析软件对PCR扩增产物的特异性条带进行灰度扫描，以GAPDH产物作校正分析，数值以两者积分吸光度比值表示。
1.3 统计学处理方法 多组间均数比较采用方差分析，两两比较采用q检验。
2 结果
2.1 苦参碱对宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用 0.125～2.0 mg/ml的苦参碱对Hela细胞均有明显抑制作用，且随着苦参碱浓度的增加和培养时间的延长，抑制作用逐渐增强。苦参碱对宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用呈时间、剂量依赖性（见图1）。
2.2 苦参碱对宫颈癌Hela细胞凋亡率的影响 0.5、1.0、2.0 mg/ml的苦参碱作用于Hela细胞48 h，随着浓度的增强，细胞凋亡率增高（见图2）。
2.3 形态学观察结果 倒置显微镜下观察，未用药细胞贴壁良好，形态正常；苦参碱作用的细胞随着药物剂量增大，细胞核/细胞质比值减小，胞质内出现大小不等的空泡，细胞活力降低，部分不能贴壁（见图3）。透射电镜下，未用药细胞具有癌细胞的一般特征，细胞核大，有内折，常染色质多，异染色质少，细胞核/细胞质比值大，有多个大核仁，形态不规则，密度不均，常见核仁边移现象；细胞内无退变的细胞器，细胞浆基质密度均匀，细胞表面微绒毛细长且密集（见图4a）。用药后（1.0 mg/ml苦参碱，作用细胞48 h），细胞核明显缩小，细胞核/细胞质比值减小，核仁减少、浓缩甚至消失，核内异染色质明显增多，并沿核膜边缘聚集增多，核膜增厚，部分模糊或消失；细胞浆内充满大小不等空泡，部分有膜包裹，系扩张的滑面内质网，部分无膜包裹，系脂肪空泡，局部线粒体空泡变性；部分线粒体浓染，有电子致密颗粒沉积；胞质局灶性溶解，出现了自噬体，内有吞噬的退变细胞器；细胞表面微绒毛变粗变短，数量减少甚至消失；细胞膜基本完整（见图4b）。
2.4 凋亡相关基因Bcl-2和Bax mRNA表达结果
凋亡相关基因Bcl-2和Bax均表达于人Hela细胞，用0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml的苦参碱作用Hela细胞。从结果看，无统计学意义，但从数值趋势上看，Bcl-2 mRNA表达随药物浓度增加而减少，而Bax mRNA的表达无明显变化，Bcl-2/Bax比值随药物浓度增加而减少（Bcl-2和Bax的mRNA值以与GAPDH mRNA比值表示，具体见表2、图5）。
3 讨论
近年来许多研究表明，传统中药苦参所含的主要成份苦参碱和氧化苦参碱具有抑制多种肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞分化及促进凋亡的作用，如肝癌细胞株HepG2[2]、人红白血病细胞株K-562[3]、肺癌A549细胞[4]、胃癌SGC-7901细胞[5]、胆管癌QBC939细胞[6]等。本实验主要观察苦参碱对宫颈癌Hela细胞的作用。
从MTT结果发现，苦参碱可显著抑制子宫颈癌Hela细胞的体外增殖，且药物作用效应随着作用时间的延长和药物浓度的增加而增加，提示苦参碱对人宫颈癌Hela细胞的增殖有抑制作用，并且具有时间和剂量依赖性。
流式细胞仪检测发现，0.5 mg/ml及更高浓度的苦参碱可使Hela细胞凋亡率增加，随着药物浓度增高，凋亡发生更加显著。形态学观察结果也显示细胞超微结构发生早期凋亡改变。提示凋亡可能是苦参碱抑制人宫颈癌Hela细胞增殖的作用机制之一。
Bcl-2家族的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一，在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因。在体内Bcl-2、Bax蛋白可形成异质二聚体，两者剂量的比率决定细胞凋亡的敏感性，Bcl-2/Bax增大则细胞存活，反之则易凋亡[7]。本实验检测Bcl-2和Bax的mRNA水平，显示Bcl-2随着药物作用时间的增加而降低，但Bax基本保持不变，Bcl-2/Bax的比值降低，且比值越小者凋亡越明显，表现出一定的剂量依赖性。可以认为苦参碱可能是通过调节Bcl-2和Bax mRNA的表达而诱导Hela细胞的凋亡，进而起到了抗肿瘤的作用，但苦参碱是通过什么途径影响Bcl-2和Bax的表达，需要进一步研究。
由于苦参碱能抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖，这为临床宫颈癌提供了更广的思路。中药活性分析已经发现苦参碱同时有升高白细胞、增强机体免疫力的作用[1]，这显示了苦参碱具有更广泛的临床应用价值。而关于苦参碱抑制人宫颈癌Hela细胞的进一步研究，可为中药苦参碱治疗宫颈癌提供更多的理论基础。
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