三种腺苷受体拮抗剂对小鼠空间记忆的影响比较
【摘要】 目的：探讨腺苷受体非特异性拮抗剂咖啡因、腺苷A1受体特异性拮抗剂DPCPX及腺苷A2A受体特异性拮抗剂SCH58261对小鼠空间记忆的影响。方法：C57BL/6J雄性小鼠65只，分成咖啡因低剂量组（10 mg/kg，n =15）、咖啡因高剂量组（50 mg/kg，n=15）、DPCPX组（5 mg/kg，n=10）、SCH58261组（5 mg/kg，n=10）和生理盐水对照组（n=15）。每日4次训练结束后立即腹腔注射给药。用Morris水迷宫检测定位航行的潜伏期和空间探索指标，评价实验动物的空间学习记忆能力。结果：①咖啡因小剂量（10 mg/kg）组分别与高剂量（50 mg/kg）组和对照组相比，定位航行试验的逃避潜伏期显著缩短，空间搜索试验穿越原平台位置的次数显著增多。②DPCPX和SCH58261对小鼠Morris水迷宫的定位航行试验的潜伏期和空间探索能力无明显影响。结论：腺苷受体非特异性拮抗剂咖啡因小剂量能够提高小鼠的空间学习记忆能力，而单用腺苷A1或A2A受体特异性拮抗剂对空间学习记忆并无明显影响，小剂量咖啡因对空间学习记忆的影响可能存在腺苷以外的调节机制。
【关键词】 腺苷A1受体 腺苷A2A受体 空间记忆 Morris水迷宫
Abstract: Objective: To investigate the effects of adenosine receptors inactivation on spatial memory in mice by non-specific adenosine receptor antagonist caffeine，A1 receptor antagonist DPCPX and A2A receptor antagonist SCH58261. Methods: Sixty-five male C57BL/6J mice were randomly assigned to five groups: caffeine (10 mg/kg), caffeine (50 mg/kg), DPCPX (5 mg/kg)，SCH58261 (5 mg/kg) and saline，by intraperitoneal injection right after the completion of the behavioral training. The mice were tested by the escape latencies of place navigation testing and the times of crossing the exact position of the former platform of probe trial testing in Morris water maze（MWM）in which spatial learning and memory were assessed. Results: ①Mice treated with caffeine at the low dose (10 mg/kg) significantly decreased the escape latencies and increased the times of crossing the exact position of the former platform in MWM, compared to the mice treated with saline. In contrast，mice treated with high doses of caffeine (50 mg/kg) had no effect on improving behavioral performance in MWM test. ②There was no significant difference in MWM performance between the mice treated with DPCPX or SCH58261 and the mice treated with saline. Conclusion: The non-selective adenosine receptor antagonist caffeine at the low dose (but not high dose) enhances spatial memory in MWM.However，selective A1 or A2A receptor antagonists are ineffective to improve spatial memory，indicating either combined inactivation of A1 or A2A receptor or additional molecular mechanisms are responsible for the memory enhancement by low doses caffeine.
Key words: adenosine A1 receptors；adenosine A2A receptors；spatial memory；Morris water maze
腺苷是脑内的嘌呤类神经递质，在细胞的能量代谢活动和兴奋状态之间起稳态调节作用，广泛分布于全身，其通过参与G蛋白耦联系统发挥多种生理作用。腺苷受体分为A1、A2和A3三种类型，其中A2型又分为A2A与A2B两个亚型[1]。近年来，腺苷在学习记忆过程中的作用逐渐受到重视，本研究通过比较三种腺苷受体拮抗剂对小鼠在Morris水迷宫（Morris water maze，MWM）中空间学习记忆的影响，探讨腺苷及其不同的受体亚型在学习记忆调节过程中的作用。
1 材料和方法
1.1 主要药品及试剂 ①咖啡因：腺苷受体非特异性拮抗剂，购自巴西Alfa Aesar公司，批号：10108515。②腺苷A1受体拮抗剂：8-环戊-1，3-二丙基黄嘌呤(8-cyclopentyl-1，3-dipropylxanthine，DPCPX)，购自美国Tocris Cookson 公司。③腺苷A2A受体拮抗剂：｛2-(2-Furanyl)-7-(2-phenylethyl)-7H-pyrazolo[4，3-e][1，2，4]triazolo[1，5-c]pyrimidin-5-amine，SCH58261｝，购自美国Tocris Cookson公司。
1.2 实验动物及分组 选用清洁级C57BL/6J小鼠，雄性，65只，年龄10～12周，体重22～24 g， 平均(22.4±3.0)g，购自上海斯来克实验动物有限责任公司。饲养系统为自动空调换气，温度（21±2）℃，湿度保持37%～42%。小鼠自由进食、进水，保持12/12 h明暗交替光照。实验操作遵循动物使用相关伦理要求。
随机分成5组：咖啡因低剂量组（10 mg/kg，n=15）；咖啡因高剂量组（50 mg/kg，n=15）；DPCPX组（5 mg/kg，n=10）；SCH58261组（5 mg/kg，n=10）；生理盐水对照组（n=15）。腹腔注射，每日4次训练结束后立即给药。
1.3 Morris水迷宫[2，3] 动物行为记录分析系统采用上海吉量软件科技有限公司的Morris水迷宫视频分析系统。摄像机头安装在水池正上方约1.5 m处，并通过线路与电脑相连。试验分两个阶段：
1.3.1 定位航行试验：连续训练5 d，记录逃避潜伏期，评价空间记忆的获得能力。
1.3.2 空间搜索试验：第6天撤除平台，记录60 s内小鼠穿越原平台所在位置的次数，反映空间参考记忆的巩固能力。
1.4 统计学处理方法 Morris水迷宫定位航行试验逃避潜伏期比较采用重复测量方差分析(Repeated measures，RANOVA)；使用重复测量数据多重比较配对的t检验法进行每个分组每个训练日之间的两两比较；使用多元方差分析法进行每个训练日每个分组之间的两两比较[4]；空间搜索试验穿越原平台所在位置的次数采用单因素方差分析（oneway ANOVA）。
2 结果
2.1 腺苷受体非特异性拮抗剂咖啡因对小鼠空间记忆的影响
2.1.1 Morris水迷宫定位航行试验结果：前3个训练日各组逃避潜伏期随时间变化逐渐缩短，其中低剂量（10 mg/kg）咖啡因组第2训练日逃避潜伏期明显低于对照组，第4训练日开始成绩趋于稳定。RANOVA统计结果：组内因素效应的方差分析示组内因素（训练天数）的F值为42.134，P=0.000，而交互效应（训练天数×组别）的F值为1.392，P=0.202，组间因素效应的方差分析示组间因素（组别）的F值为3.240，P=0.048。进一步试验后的多重比较示，对照组与咖啡因低剂量组之间逃避潜伏期比较P=0.031，对照组与咖啡因高剂量组逃避潜伏期比较P=0.819，咖啡因低剂量组与咖啡因高剂量组逃避潜伏期比较P=0.029，低剂量咖啡因组逃避潜伏期显著短于对照组及高剂量组。每个分组每个训练日之间及每个训练日每个分组之间的两两比较见表1。
2.1.2 Morris水迷宫空间搜索试验结果：单因素方差分析结果提示，低剂量的（10 mg/kg）咖啡因组在第6天撤除平台后穿越原平台位置的次数显著高于高剂量（50 mg/kg）组及对照组（F=3.538，P=0.037），可见低剂量的咖啡因能够提高小鼠的空间搜索记忆能力（见图1）。
2.2 腺苷A1及A2A受体特异性拮抗剂对小鼠空间记忆的影响
2.2.1 Morris水迷宫定位航行试验结果：各组前3个训练日逃避潜伏期随时间变化逐渐缩短，第4训练日开始成绩趋于稳定。RANOVA统计结果：组内因素（训练天数）的F值为30.441，P =0.000，而交互效应（训练天数×组别）的F值为0.44，P =0.895，组间因素效应的方差分析示组间因素（组别）的F值为0.361，P =0.699，两两比较见表2。
2.2.2 Morris水迷宫空间搜索试验结果：DPCPX与SCH58261对小鼠空间搜索试验中穿越原平台次数与对照组相比差异无显著性（见图2）。
3 讨论
腺苷是一种十分重要的神经调质，已知的腺苷受体有A1、A2A、A2B和A3等4种[1]，其中腺苷A1受体和多巴胺D1受体以及腺苷A2A受体和多巴胺D2受体分别以二聚体的形式共存于基底神经节，广泛参与运动、情绪、药物依赖等生理过程[5，6]。近年来，许多证据表明，腺苷参与学习记忆的调节过程。目前已经发现脑内与记忆相关的脑区（海马、皮层和纹状体等）腺苷的活动随年龄增强，可能是老年记忆障碍的一个重要因素；腺苷受体阻断剂茶碱可以改善东莨宕碱诱发的大鼠记忆障碍[7]。我们通过比较三种腺苷受体拮抗剂对小鼠在MWM中空间学习记忆的影响，结果发现：单用腺苷A1和A2A受体特异性拮抗剂对空间学习记忆无明显影响；腺苷受体非特异性拮抗剂咖啡因小剂量能够提高小鼠的空间学习记忆能力，而高剂量咖啡因对空间学习记忆无明显影响。
关于腺苷受体特异性拮抗剂对认知功能调节的研究，目前的一些结论不尽一致。张丹参等[8]通过避暗试验观察到腺苷A1受体阻断剂DPCPX可以通过抑制脑AChE活性和改变脑内Glu/GABA比值影响学习记忆过程；尽管用DPCPX慢性阻滞腺苷A1受体的大鼠,表现出行为学的损伤，但腺苷A1受体的小鼠几乎没有行为学阳性结果[9]。联合应用A2A受体拮抗剂ZM241385可以逆转大鼠被A1受体的激动剂CPA和A2A受体激动剂CGS21680造成的遗忘效应[10]。使用A2A受体拮抗剂能逆转经利血平处理后的大鼠的短期社会认知障碍[11]。在我们的研究中，腺苷A1受体特异性的拮抗剂DPCPX和A2A受体特异性的拮抗剂SCH58261对小鼠Morris水迷宫的定位航行试验的潜伏期和空间搜索能力无明显影响，可能与特异性的拮抗剂本身溶解度和稳定性的影响，以及给药的方式和时机、剂量和浓度等有关，具体有待进一步的研究。
咖啡因是一种非选择性的磷酸二酯酶抑制剂, 其基本化学结构含有甲基黄嘌呤类活性成分，具有广泛的药理活性，在药上有多种分子靶点，包括非特异性拮抗腺苷A1和A2A受体，抑制磷酸二酯酶，抑制cAMP的降解而升高胞内cAMP，拮抗GABA受体和其他作用[12]。Angelucci等[13]发现咖啡因可以提高大鼠Morris水迷宫空间记忆的成绩。邵碧霞[14]研究发现咖啡因可以通过阻断中枢腺苷酸环化酶A1受体，提高大鼠工作记忆能力。我们的研究也发现小剂量咖啡因能够提高小鼠的空间学习记忆能力，但是无论腺苷A1、A2A受体均未发现类似的作用，可见小剂量咖啡因部分通过拮抗脑腺苷A2A受体以提高小鼠的空间学习记忆能力。所以估计咖啡因对认知功能的影响与多个作用位点有关，可能存在腺苷以外的作用机制或者腺苷对学习记忆的影响需要A1和A2A受体的同时阻断。
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[13]Angelucci ME, Cesario C, Hiroi RH, et al. Effects of caf-feine on learning and memory in rats tested in the Morris water maze [J]. Braz J Med Biol Res, 2002, 35 (10):1201-1208.
[14]邵碧霞.咖啡因对大鼠工作记忆促进作用及其机制的研究[J].中国药学杂志,2006, 41(7):512-514.
