HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位的预测与鉴定
来源：岁月联盟
时间：2010-07-12
【关键词】 人乳头瘤病毒 E7抗原 淋巴细胞 Th表位
Abstract: Objective: To identify HLA-DRB1*0301restricted Th epitope derived from human papillomavirus 18 E7 antigen. Methods: The primary structure of human papillomavirus 18 E7 antigen was analyzed using T cell epitope predictive algorithms SYFPEITHI and three epitope candidates (P1, P2 and P3) were obtained. The candidate epitopes were synthesized with solid phase strategies, purified with reverse phase HPLC and identified with mass spectrometry. Peptide-specific Th cells were induced from the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of HLA-DRB1*0301 positive healthy donors by stimulating candidate epitopes. Proliferative activity was analyzed with Brdu cell proliferation assay. Cell phenotype was analyzed by FACS. Results: Peptide P1（HPV18 E780-94）could induce proliferative activity in vitro specifically and effectively. Conclusion: Peptide P1（HPV18 E780-94）can be the HLA-DRB1*0301restricted Th epitope of human papillomavirus 18 E7 antigen.
Key words: human papillomavirus; E7 antigen; lymphocyte; T helper lymphocyte epitopes
作为妇女最常见的的恶性肿瘤之一，宫颈癌的死亡率位于全球妇女癌症死亡的第二位[1]，而人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）感染是宫颈癌发生的首要因素和中心环节[2]。HPV早期基因E7的表达在细胞癌变进程和维持癌细胞恶性表型方面起着重要作用，是维持肿瘤细胞处于转化状态所必需的[3]。E7抗原是HPV相关肿瘤特异性抗原，具有良好的免疫原性，成为研究最多的靶抗原。Th细胞免疫应答在特异性免疫应答中，可以辅助B细胞产生抗体以及辅助CTL活化而发挥免疫效应，并且激活的Th也能直接发挥免疫效应，因此Th表位的鉴定以及以此为基础的表位疫苗的研究也日益受到重视。本研究以HPV18 E7抗原作为靶标,预测并合成Th表位，以淋巴细胞增殖试验进行筛选和鉴定，初步获得HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位。
1 材料和方法
1.1 靶抗原 由Genbank获得的HPV18 E7抗原由105个氨基酸组成，其序列见[4]。
1.2 Th表位预测 SYFPEITHI是能在互联网上免费使用的MHC-Ⅱ类表位预测的方法。将HPV18 E7抗原氨基酸序列输入(http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi)SYFPEITHI网站，选择EPITOPE-PRE-DICTION进入Th表位预测界面，选择氨基酸长度为15-mers，基因型为HLA-DRB1*0301(DR17)、HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401(DR4Dw4)、HLA- DRB1*0701、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1501 (DR2b)，预测其MHC-Ⅱ类分子结合肽。经过比较分析，HLA-DRB1*0301(DR17)基因型较常见，其健康者血源容易获得，因此我们选取基因型为HLA-DRB1*0301所得的积分最高的3个多肽，分别命名为P1、P2、P3。
1.3 多肽的合成、纯化及鉴定 运用标准Fmoc方案在ABI431A型多肽合成仪上进行多肽的合成，在Delta600型HPLC上进行纯化和纯度分析，纯化后多肽的分子量测定在API2000型质谱仪上进行。当分子量测定值与理论值相符合时，所得多肽即为靶肽[5]。
1.4 人外周血淋巴细胞的分离 在实验室采集HLA-DRB1*0301阳性健康人外周血，按人淋巴细胞分离液（Cedarlane，Canada）操作步骤分离外周血单核细胞（PBMC），细胞计数板计数。
1.5 淋巴细胞培养及增殖实验 以含10%自体血清（抽取同一人新鲜血室温斜置0.5～1 h，再离心3 000 r/min×20 min，56 ℃，30 min灭活，-20 ℃分装保存）的IMDM培养液（Gibco）调整细胞浓度至2×106/ml，于96孔平底培养板（Costar）中加上述淋巴细胞悬液及合成多肽，使终体积为200μl/孔，2×105个细胞/孔，多肽终浓度为10μg/ml。阳性对照孔加植物血凝素(PHA)（4μg/ml），阴性对照孔不加多肽，空白对照孔只加培养液。每组均设4个复孔，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养6 d，培养结束前24 h加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)20μl(Roche，Germany)。用酶标仪测定吸光度(OD)值，OD值=实验组OD值-空白对照组OD值。
1.6 MHC限制性分析 进行1.5步骤淋巴细胞增殖试验时，另设一组加入鼠抗人HLA-DR 抗体，于37 ℃、5% CO2 培养1 h后再加入稀释好的合成多肽P1(10μg/ml)，终体积为 200μl/孔，每组做4个复孔。其余步骤同前。
1.7 效应细胞表型分析 用流式细胞术对效应细胞进行表型分析。实验管加入PE标记的抗人CD3和FITC标记的抗人CD4各50μl，对照管加入等量的PE及FITC标记的同型抗体，与效应细胞孵育后用流式细胞仪计数分析。
1.8 统计学处理方法 所有数据均采用SPSS12软件处理，数据以(±s)表示，显著性检验用方差分析。
2 结果
2.1 T细胞表位预测及合成 采用SYFPEITHI软件进行Th表位的预测，选定软件评分较高的3条，多肽经合成纯化后，测定纯度均在90%以上，经质谱分析各肽的分子量均与理论值相符，说明合成的多肽正确，见表1。
2.2 人外周血淋巴细胞分离结果 经淋巴细胞分离液分离、收集白雾层细胞，其中PBMC占90%以上(细胞存活率大于95%)，粒细胞占0～5%，血小板小于1%，红细胞占0～2%。PBMC的收集效率为50%～65%。
2.3 淋巴细胞增殖试验 用合成的多肽在体外刺激人PBMC，P1、P2、P3刺激淋巴细胞增殖的OD值分别为(1.097±0.040)、(0.749±0.035)、(0.835±0.017)，阴性对照(NC)组为(0.765±0.025)，NC组与P1组比较差异有显著性(P<0.01)，NC组与P2组比较差异无显著性(P>0.05)，NC组与P3组比较差异无显著性(P>0.05)。PHA组为(0.923±0.036)，与NC组相比也显著增加(P<0.01)。结果表明，预测获得的3个候选表位中的P1能刺激淋巴细胞增殖。
2.4 MHC限制性分析 抗原特异性CD4+T淋巴细胞识别特定的MHC-Ⅱ类分子与肽的复合物，T细胞受体(TCR)与 MHC-多肽之间的作用可以被相应抗MHC抗体阻断。为了分析多肽特异性淋巴细胞增殖的MHC限制性，我们在进行淋巴细胞增殖试验时加入鼠抗人HLA-DR抗体后检测OD值为(0.352±0.015)，NC组与抗HLA-DR组比较差异有显著性（P<0.01)，P1组与抗HLA-DR组比较差异有显著性(P<0.01)，表明，鼠抗人HLA-DR 抗体可以阻断P1对淋巴细胞的增殖效应。
2.5 多肽刺激淋巴细胞增殖的表型分析 采用流式细胞计数分析细胞表型，重复3次。淋巴细胞与合成多肽培养前CD4+T淋巴细胞占外周血单核细胞的比例为(44.87±1.06)%(见图1A)；在刺激培养6 d后，未加合成多肽刺激的阴性对照的CD4+T淋巴细胞的比例为(46.34±0.89)%(见图1B)，与刺激前相比差异无显著性(P>0.05)；P1刺激后CD4+T淋巴细胞为（56.04±1.76）%(见图1C)，与刺激前相比显著增加(P<0.01)，与NC组相比也有显著增加(P<0.01)，见图1。
3 讨论
HPV感染后机体产生针对HPV的体液与细胞免疫应答，大多数(约90%)女性的免疫系统可以把进入体内的HPV清除，只有少数女性由于机体不能建立有效的免疫反应（如肾移植患者和HIV感染者），尤其是局部细胞免疫，无法消灭进入体内的HPV，造成HPV持续感染。这就需要借助免疫学手段来帮助清除体内病毒病灶，因此迫切需要寻找HPV性疫苗。HPV治疗性疫苗主要有多肽疫苗、蛋白疫苗、病毒载体疫苗、嵌合型乳头瘤病毒VLP疫苗(cVLPs)、核酸疫苗、基于树突状细胞（DC）的肿瘤疫苗。其中合成多肽疫苗安全，容易储存和处理，有理想的靶特异性，含有针对高危型HPV的E6和E7蛋白中的多个能激发CTL(细胞毒T淋巴细胞)和Th的抗原表位，能借助基因工程技术大量生产，是一类很有潜力的疫苗。目前对HPV16治疗性多肽疫苗研究较多。而HPV18是世界大部分地区宫颈癌患者中次于HPV16的第二位常见高危HPV，HPV18较HPV16具有更强的恶性转化能力，与宫颈腺癌显著相关，因此,目前HPV18疫苗的研制和开发正日益受到关注[6]。
以往有关HPV性多肽疫苗的研究主要是针对HLA-A2限制性CTL表位开展的。Andress等[7]在体外试验中，给予抗原肽HPV16 E711-20刺激PBMC（HLA-A2阳性健康人来源）发现，HPV16 E711-20能诱导产生特异性的CTL，并能识别和杀伤 HPV16 E711-20加载的T2细胞，同时发现，HPV16 E711-20特异性的CTL还能够识别和杀伤表达HPV16 E7、E6蛋白的肿瘤细胞，以上结果表明，HPV16 E711-20具有高的免疫原性，是HPV免疫的优势表位。张乾等[4，8]采用超基序、多项式和量化基序方案相结合的方法，预测HPV18 E77-15为靶抗原HPV18 E7的HLA-A2限制性CTL表位，并在其后的体外试验中，经特异性的五聚体检测发现，HPV18 E77-15能够诱导HLA-A2阳性健康人PBMC产生特异性的CTL增殖，具有良好的免疫原性。Van等[9]通过重叠肽法经体外淋巴细胞增殖试验鉴定了HPV16 E7的3个Th表位（DR15/E750-62、DR3/E743-77、DQ2/E735-50)。Muderspach等[10]用HPV16 E711-20和HPV16 E786-93 2个CTL表位接种18例HPV16阳性的重度宫颈上皮内瘤变（CIN Ⅲ）和重度外阴上皮内瘤变（VIN Ⅲ）患者，发现18例中有9例患者CIN/VIN病变部分或完全消退，阴道镜下发现3例病变完全消退，6例病变缩小>50%，15例HPV DNA转阴。结果表明，这些抗原表位能有效诱生特异性CTLs杀伤感染细胞，清除感染的病毒和明显改善机体对HPV的免疫功能。
近来分子流行病学研究表明，宫颈癌与MHC-Ⅱ分子较MHC-I分子有着更高的相关性。MHC-Ⅱ类基因型HLA-DR15、DQB1*0602、DQB1*0303在瑞典宫颈癌患者中出现率较高，而法国女性中具备HLA-DRB1*1301或DRB1*1302的患者不易成宫颈癌，说明MHC-Ⅱ类基因与宫颈癌形成相关，因此研究病毒蛋白的MHC-Ⅱ限制性表位对患者的免疫治疗具有重要的意义。近年的研究策略已开始关注CD4+T细胞对HPV感染的影响。Zwaveling等[11]的研究表明，CpGDNA同HPV16 E743-77（含有H-2 Kb限制性CTL表位HPV16 E749-57及Th表位E748-54）35肽合用，可使10只宫颈癌移植瘤小鼠中的8只肿瘤完全消退，另2只小鼠的肿瘤生长也较对照组缓慢，而CpGDNA同HPV16 E749-57肽合用仅能使9只宫颈癌移植瘤的小鼠中的3只肿瘤完全消退。Dell等[12]分别经皮肤给予单个HPV16 E749-57、HPV16 E7 49-57联合Th表位E748-57和B细胞表位E744-48免疫C57BL/6小鼠，结果发现，只有联合表位（CTL+Th+B cell)才能诱导出强烈的CTL反应，表明Th细胞在CTL反应中起着重要的作用。以上研究证实了Th细胞在抗HPV的免疫保护中的重要作用，同时也表明，HPV抗原的CTL表位与Th表位合理组合设计后的联合多肽疫苗可能更有效，但这需先鉴定出Th表位。本研究鉴定了HPV18 E7抗原的一个Th表位，为进一步研究该表位的功能特点及作为多肽疫苗的基础研究提供实验基础。
本研究采用软件预测、淋巴细胞功能试验验证的方法鉴定出HPV18 E7抗原Th表位。以往鉴定T细胞表位的方法有：①酶解法。②用噬菌体显示肽库技术筛选模拟表位。③酸洗脱法：将表位从MHC-Ⅱ分子或单抗上洗脱下来，继而进行肽段测序。④合成重叠肽法：根据抗原蛋白的氨基酸序列合成一系列重叠肽段，然后通过淋巴细胞功能试验确定可被T细胞识别的肽段。这些方法工作量大、费时、费力，但是鉴定的T细胞表位较全面，漏筛的可能性小，同时也为表位预测提供了大量的信息。目前多采用对表位进行预测、分子模拟、人工合成和抗原性鉴定的方法。近年来，随着对MHC-Ⅱ类分子与抗原肽结合的认识，随着机技术和生物信息学的发展，我们可以在几分钟内用计算机软件分析整个基因组，再将预测获得的候选表位用实验方法验证，这样就能够快速准确地鉴定出抗原表位。在鉴定表位之前用软件分析预测一些可能的表位，不仅可减少工作量、节省经费，而且还能提高实验的成功率。SYFPEITHI是由德国教授Rammensee设计的，主要预测与MHC-Ⅱ类分子特异性结合的多肽，根据不同的实验动物，选择不同的基因型。虽然任何预测软件均不能达到100%准确性，或许存在预测分值较高但并不能真正刺激淋巴细胞增殖的多肽，但此方法能大大降低寻找抗原表位的盲目性，降低实验成本。
在预测获得的3条多肽中，经淋巴细胞增殖试验证实P1能刺激淋巴细胞增殖，通过流式细胞计数对效应细胞进行表型分析，结果表明，经P1刺激后CD4+T淋巴细胞的比例较培养前以及未加多肽刺激的对照组均有明显增加，未加多肽刺激的对照组相对培养前无明显增加。由于抗原特异性CD4+T淋巴细胞识别特定的MHC-Ⅱ类分子与肽的复合物，T细胞受体(TCR)与MHC-多肽之间的作用可以被相应抗MHC抗体阻断，因此在加入多肽刺激前加入鼠抗人HLA-DR抗体不仅不能促进增殖，反而较未加多肽刺激的对照组大大降低，说明多肽刺激淋巴细胞增殖是有MHC限制性的。综上所述，本研究可初步证实P1（HPV18 E780-94）可能为HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性的Th表位。
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