环境激发吗啡条件性位置偏爱重现大鼠海马PSD-95的蛋白和DNA表达

【摘要】  目的:检测吗啡条件性位置偏爱（conditioned place preference，CPP）重现大鼠海马区突触后致密质-95（PSD-95）的蛋白和DNA表达，观察PSD-95对吗啡成瘾记忆的影响。方法:建立大鼠吗啡CPP模型，消退后，通过环境来诱发CPP的重现，应用免疫组化和RT-PCR的方法，观察吗啡CPP重现组大鼠海马区PSD-95的表达，并与吗啡CPP消退组、生理盐水对照组进行比较。结果:吗啡CPP环境激发组、吗啡CPP消退组与生理盐水对照组相比，以及吗啡CPP环境激发组与吗啡CPP消退组相比，海马区PSD-95的表达明显降低，差异具有高度显著性 (P<0.01)。结论:吗啡CPP重现和消退大鼠海马区PSD-95表达明显降低，海马区PSD-95可能未参与成瘾记忆。

【关键词】  吗啡 条件性位置偏爱 环境激发 海马 突触后致密质-95

    Abstract:  Objective: To observe the expression of protein and DNA of postsynaptic density protein-95(PSD-95) in hippocampus of rats with morphine conditioned place preference(CPP) after environment induced reinstatement, and to evaluate the influence of PSD-95 on addiction memory. Methods: CPP rat model was established with morphine injection and reinstatement was induced by environment after extinction of CPP. The expression of PSD-95 protein and DNA in hippocampus of rats in reinstatement group of morphine CPP were observed, and was compared with those in extinction group of morphine CPP and control group. Results: The expression of PSD-95 in hippocampus was significantly decreased in rats in reinstatement and extinction group of morphine CPP compared with those in control group(P<0.01), and it was significantly decreased in reinstatement group compared with those in extinction group(P<0.01). Conclusion: The expression of PSD-95 in hippocampus is significantly decreased in rats in reinstatement and extinction group of morphine CPP. PSD-95 in hippocampus has take part or not in addict memory.

    Key words:  morphine; conditioned place preference; environmental induce; hippocampus; postsynaptic density protein-95

    毒品成瘾研究的一个最大挑战是毒品滥用引起的复燃，但到目前为止，复燃的神经机制尚不清楚。药物成瘾是一个复杂的生物学、心和社会学问题，近年来越来越多的证据表明，学习记忆在成瘾行为的形成和保持中发挥重要作用。联系着环境刺激和滥用毒品效应的不良适应性记忆被公认为是引起毒品成瘾习惯复燃和持久的主要原因[1]。本实验通过利用SD大鼠吗啡条件性位置偏爱（conditioned place preference，CPP）-消退-环境激发模型，研究吗啡成瘾记忆重现状态下，大鼠海马区突触后致密质95（PSD-95）的表达。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物  选用健康普通级SD大鼠24只（3月龄），雌雄不限，体重为(250±20)g（221～275 g），由温州医学院实验动物中心提供。按随机抽样分组原则，分为生理盐水对照组(N组)、吗啡CPP环境激发组(MR组)和吗啡CPP消退组(ME组)，每组8只，分笼喂养，自由进食、饮水。观察其活动、饮食量、饮水量和大便等情况。

    1.2  实验试剂  盐酸吗啡(沈阳第一制药厂生产)，盐酸纳洛酮（北京四环制药厂生产），免疫组化抗体（北京博奥森生物技术有限公司生产），Trizol (上海生物工程有限公司生产)，RT-PCR试剂盒(上海Promega生物产品有限公司生产)，引物序列（上海生物工程有限公司合成），PSD-95上游引物序列：5'- CAA GAC CGA CAT CAC AGG A -3'，下游引物序列：5'- ACG GCA AGG GCG AAT -3'，预计目标片段长289 bp，β-actin（为内参照）上游引物序列：5'- TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A -3'，下游引物序列：5'-CAT CGG AAC CGC TCG TTG CCA ATA G -3'，预计目标片段长385 bp。

    1.3  CPP实验箱及预实验

    1.3.1  CPP实验箱：体积为60 cm×30 cm×30 cm，分为相同体积的左右两箱，左箱为黑色，右箱为白色，中间为一30 cm高的活动隔板，箱壁安装摄像头，与机相连。整个实验过程保持箱内的光线、色调、气味等环境条件一致。

    1.3.2  动物预实验：测试实验鼠的天然环境偏爱。让大鼠在CPP实验箱内适应2 d，每天1 h，第3天记录15 min内大鼠在白箱内的停留时间。本实验中大鼠在黑箱中停留时间比白箱时间明显延长，故白箱为非偏爱侧，采用倾向性实验程序，把白箱定为伴药侧。

    1.4  吗啡CPP模型的建立、消退和激发

    1.4.1  吗啡CPP模型的建立：采用腹腔递增注射盐酸吗啡的方法建立吗啡依赖模型。每天2次(8: 00，16:00)，连续7 d。每天每次具体剂量（单位：mg·kg-1）：5、5、10、10、15、15、20、20、30、30、40、40、50、50。CPP的训练与依赖模型的建立同时进行，在每次注射吗啡后将大鼠放入白箱内50 min，间隔2 h后，再注射生理盐水放入黑箱内50 min。吗啡依赖大鼠第8天于吗啡注射前2 h注射盐酸纳洛酮5 mg·kg-1，进行催促试验来诱发戒断症状，对湿狗样颤抖、清理皮毛、站立、吞咽、跳跃、齿颤、上睑下垂、流涎、腹泻等症状给予评分。

    1.4.2  吗啡CPP的消退：实验鼠第8天、第15天分别进行测试，抽掉CPP实验箱隔板，使大鼠自由穿梭，记录白箱内停留时间。

    1.4.3  吗啡CPP的环境激发：在第8天测试后，于第14天进行环境激发，分别于8:00、16:00注射生理盐水后放入光线、色调、气味等环境条件完全一致的白侧箱内50 min。第15天测试，抽掉CPP实验箱隔板，使大鼠自由穿梭，记录白侧箱停留时间。

    1.4.4  生理盐水对照组：用生理盐水取代盐酸吗啡，其余实验方法和条件与使用吗啡实验鼠一致。

    1.5  免疫组化方法  测试后大鼠灌注固定，取脑，参照鼠脑立体定位图谱，取海马区域组织，包埋切片，操作按试剂盒说明书进行，苏木素复染后观察拍片。

    1.6  提取RNA，RT-PCR方法检测PSD-95  测试后大鼠麻醉后断头处死，于冰上快速开颅取脑并分离出海马区，提取RNA、RT-PCR方法和操作按试剂盒说明书进行，分析软件为Gel-pro 3.1分析系统。

    1.7  统计学处理方法  数据统计由SPSS10.0软件包完成，多组计量资料经方差分析后进行两两比较。

    2  结果

    2.1  吗啡CPP模型戒断症状评分及白箱内停留时间  见表1。

    2.2  PSD-95蛋白质免疫组化表达结果  在各组实验鼠海马区，神经细胞胞浆内均可见棕黄色免疫反应产物沉积。N组棕黄色颗粒明显而密集（见图1a），ME组棕黄色颗粒稍密集（见图1b），MR组棕黄色产物浅淡而稀疏（见图1c）。

    2.3  RT-PCR检测海马区PSD-95 DNA表达结果  见表2和图2。

    3  讨论

    临床和实验证明，吗啡的成瘾记忆十分生动和强烈，可以终生不忘，即使相隔数十年，只要回到相关的环境，即可激发强烈的渴求感，联系着环境刺激和滥用毒品效应的不良适应性记忆被公认为是引起毒品成瘾复燃和持久的主要原因。海马是参与毒品依赖的一个重要脑区，又是学习记忆的一个关键区域，本实验利用SD大鼠吗啡CPP的建立-消退-环境激发模型，研究吗啡成瘾记忆重现状态下，大鼠海马区PSD-95的蛋白和DNA表达，从而探讨PSD-95是否参与了吗啡的成瘾记忆。

    PSD是位于突触活性区突触后膜下方的一种亚微结构，对应激反应很敏感，多种外界刺激可引起不同脑区PSD的变化。PSD-95在信号传导、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导的长时程增强中起着重要作用，并对突触传递和可塑性具有重要影响，并参与了学习与记忆、皮质环路的形成。研究证明，敲除脊髓PSD-95能阻止大鼠吗啡耐受的形成，说明PSD-95也参与了吗啡成瘾[2]。

    本实验发现，吗啡CPP激发组和消退组大鼠海马区PSD-95表达明显降低，与生理盐水对照组对比，差异具有高度显著性(P<0.01)，其原因与吗啡的损害有关。吗啡依赖形成过程中，海马神经细胞由于缺血低氧而出现变性坏死和退行性改变[3]，而PSD-95的活性和含量是受神经元活性控制的，随着神经细胞数量减少和活性降低，PSD-95的表达也会随之降低。吗啡对学习记忆的损害早已被证实，PSD-95表达明显降低，反映了突触后膜NMDA受体数量的减少和位置发生改变，这既会影响长时程增强的形成，也会影响递质和受体的准确结合，最终在行为上表现为学习记忆障碍。

    吗啡对学习记忆的影响是双重的，一方面可以对学习记忆造成损害，另一方面，多次给予吗啡却可引起记忆恢复和重新巩固[4，5]，一些不良适应性记忆却得到了加强，导致依赖者有着强烈的药物渴求和复吸倾向。本实验发现，吗啡CPP环境激发组与生理盐水对照组对比，海马区PSD-95的表达明显降低，差异具有高度显著性(P<0.01)。这一结果却出乎我们的意外。本实验行为学观察显示，吗啡CPP环境激发组比吗啡CPP消退组在白箱内停留时间明显延长，差异具有高度显著性，说明环境诱发了记忆的恢复和重新巩固，理论上说参与成瘾记忆的成分表达应该增高，而本实验结果却与此相反。海马是参与精神依赖的一个脑区，也是啮齿类动物空间学习记忆的中枢，且吗啡成瘾对空间学习记忆的损害也早已被证实[6]，本实验结果说明成瘾记忆与空间记忆存在有分层现象，海马区PSD-95 的表达进一步降低，可能为空间记忆或其他类型记忆进一步被损伤所致。研究表明，成瘾记忆相关蛋白和基因的异常表达是药物成瘾长期存在的重要原因，成瘾记忆在一定条件下是可以改变的，并和一般的空间记忆或情绪记忆的机制存在差别[7-9]，我们的研究也说明了这一点。另外，海马区PSD-95 的表达明显降低，说明海马区PSD-95可能未参与成瘾记忆。以前的研究表明，PSD-95不仅参与了学习记忆也参与了吗啡成瘾，而既参与精神依赖又参与学习记忆的脑区，除了海马外，还有杏仁核、纹状体、额叶皮质等。对于其他脑区的PSD-95是否参与成瘾记忆，以及海马区其他的一些既参与吗啡依赖又参与学习记忆的神经递质是否参与了成瘾记忆，我们将作进一步的研究。

【】
  [1] Lee JL, Di Ciano P, Thomas KL, et al. Disrupting reconsolidation of drug memories reduces cocaine-seeking behavior[J]. Neuron, 2005, 47(6): 795-801.

[2] Liaw W J, Zhang B, Tao F, et al. Knockdown of spinal cord postsynaptic density protein-95 prevents the development of morphine tolerance in rats[J]. Neurosci, 2004,123(1):11-15.

[3] 朱华,李利华,杨举伦,等. 不同时程吗啡依赖大鼠依赖相关脑区的病理组织学观察[J]. 温州医学院学报,2005,35(2):88-91.

[4] Zarrindast MR, Farahmandfar M, Rostami P, et al. The influence of central administration of dopaminergic and cho-linergic agents on morphine-induced amnesia in morphine-sensitized mice[J]. J Psychopharmacol, 2006,20(1): 59-66.

[5] Zarrindast MR, Khalilzadeh A, Rezayat SM. Influence of intracerebroventricular administration of histaminergic drugs on morphine state-dependent memory in the step-down passive avoidance test[J]. Psychopharmacology, 2005, 74(2):106-112.

[6] 马光瑜,樊小力,徐小虎,等. 吗啡成瘾对大鼠及小鼠学习与记忆能力影响的实验研究[J]. 行为医学,2000,9(5):329-331.

[7] Nestler E J. Common molecular and cellar substrates of addic-tion and memory[J]. Neurobio Learn Mem, 2002, 78(3): 637-647.

[8] Milekic MH, Brown SD, Castellinic, et al. Persistent dis-ruption of an established morphine conditioned place preference[J]. J Neurosic, 2006, 26(11): 3010-3020.

[9] Lee JL, DiCiano P, Thomas KL, et al. Disrupting consoli-dation of drug memories reduces cocaine-seeking behavior [J]. Neuron, 2005, 47(6): 795-801.