第三丁基过氧化氢诱导MIN6细胞损伤
【摘要】 目的通过第三丁基过氧化氢(t?BHP)诱导小鼠胰腺β细胞,模拟体外氧化应激的细胞模型,观察氧化损伤对β细胞生长的影响。方法体外培养小鼠β细胞株MIN6,MTT法测定细胞存活率,AO?EB荧光显微镜观测,Annexin?Ⅴ?PI染色流式细胞技术定量定性分析细胞凋亡率及坏死率。结果MTT显示,t?BHP(12.5～200 μmol/L)作用不同时间后可明显抑制MIN6细胞的生长,并呈现一定的时效和量效关系;AO?EB荧光显微镜及Annexin?Ⅴ?PI流式细胞检测证实,25 μmol/L浓度的t?BHP诱导β细胞的损伤作用以凋亡为主,而更高浓度的t?BHP使细胞由凋亡转向坏死。结论t?BHP可用于体外模拟β细胞氧化应激损伤的模型。
【关键词】 叔丁基过氧化物 胰岛 细胞凋亡 氧化性应激 疾病模型 动物
氧化应激及其自由基引起的β细胞功能破坏及数量的减少可能是糖尿病发生的重要的病理生理机制之一。氧化损伤主要由活性氧物质和活性氮物质所致,它们是细胞代谢过程中产生的含氧或含氮的活性产物,可通过脂质过氧化等途径诱导组织细胞损伤,具有重要的生理和病理意义。研究表明,氧化损伤参与了糖尿病及其并发症的发生与发展[1?2]。本研究以小鼠胰腺β细胞株MIN6细胞为实验对象,研究氧化物质——第三丁基过氧化氢(tert?butylhydroperoxide,t?BHP)对MIN6细胞的损伤效应,探讨氧化剂t?BHP模拟体外胰腺β细胞氧化应激损伤的量效模型。
1材料与方法
1.1药物及试剂t?BHP[(CH3)3COOH]、四甲基偶氮唑蓝(MTT，美国Sigma公司)。DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco BRL公司)。AnnexinV?碘化丙啶(PI)染色试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)。
1.2方法
1.2.1细胞培养与处理MIN6细胞(具有胰岛β细胞生理特性的小鼠胰岛素瘤细胞株)由上海瑞金赠送。选用第26～30代作为研究对象,于含15%FBS的MDEM培养液中,37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,80%汇合时消化。以每孔密度5×105 mL?1细胞接种于6孔板,培养18 h后,用t?BHP处理;对照组以新鲜无血清培养基培养。规定时间检测各项指标。
1.2.2MTT试验在96孔培养板中,每孔接种100 μL共 5×104 个细胞,不同浓度(12.5,25,50,100,200 μmol/L)的t?BHP 作用15,30,45,60 min后,每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL,37 ℃孵育4 h后加入终止液(含10%SDS、5%异丙醇、0.012 mol/L盐酸)终止培养。37 ℃孵育过夜,次日以570 nm波长测定各孔D(570 nm)值,细胞存活率。实验重复3次。
1.2.3AO?EB染色荧光显微镜观测MIN6细胞经不同浓度的t?BHP作用1 h后分别加入吖啶橙(AO)及溴化乙啶(EB),置于荧光显微镜(Nikon 2000,日本尼康公司)下观察细胞损伤的形态。
1.2.4Annexin?Ⅴ?PI染色流式细胞技术MIN6细胞经不同浓度的t?BHP作用1 h后,胰酶消化,冷PBS洗细胞2次后进行Annexin?V?FITC、PI 染色,染色步骤参照试剂盒说明书,细胞经处理后于流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)检测,CellQuestTM 软件分析结果。实验重复3次。
1.3统计学处理数据值以x±s表示。采用SigmaStat 3.5,多组间比较用单因素方差分析。
2结果
2.1MIN6细胞的存活不同剂量的t?BHP(12.5～200 μmol/L)作用于MIN6细胞(15～60 min)后,MTT分析结果见图1。随t?BHP作用剂量的增加以及时间的推移,MIN6细胞的存活率下降(P＜0.01),提示t?BHP可抑制MIN6细胞生长,并呈显一定的量效和时效关系。
2.2MIN6细胞的损伤效应不同浓度的t?BHP(12.5～200 μmol/L)作用MIN6细胞60 min后,12.5 μmol/L即可引起细胞凋亡,25 μmol/L细胞凋亡更明显,>50 μmol/L则出现更多的坏死细胞(图2)。流式细胞定量定性分析,细胞凋亡在25 μmol/L达到最高比例[(56.90±6.07)%,P＜0.001],更高浓度的t?BHP使细胞由凋亡转向坏死,同时存活的细胞随t?BHP剂量的增加逐渐减少(图3),提示t?BHP可抑制MIN6细胞的存活率,并且低浓度t?BHP可诱导MIN6细胞发生凋亡性损伤,高浓度t?BHP可直接引起β细胞死亡。
3讨论
氧化应激引起的组织细胞损伤是常见的一种病理生理过程。氧化应激过程中产生的大量活性氧
A~F:浓度分别为0,12.5,25,50,100,200 μmol/L.凋亡细胞(黄绿色，核固缩，核偏移一侧)和坏死细胞(红色,EB染色阳性).标尺＝50 μm.
可通过细胞脂质过氧化、损伤DNA分子、调节细胞凋亡相关基因等途径,引起组织细胞损伤。本研究结果发现,氧化剂t?BHP作用于小鼠胰腺β细胞株MIN6细胞后,细胞存活率明显下降,并呈现一定的时效和量效关系,即低剂量(1.25 μmol/L)t?BHP就可以引起MIN6细胞发生凋亡性损伤,更高浓度的t?BHP使细胞由凋亡转向坏死,揭示了氧化应激损伤胰腺β细胞的量效模型。
过氧化氢(H2O2)已经被用于研究体外氧化应激的细胞模型[3?4],然而,H2O2在体内外化学性质不稳定,其作用时间一般不超过30 min。t?BHP是过氧化氢的类似物,化学性质较稳定,在应用于研究作用较长时间的氧化损伤模型方面有其优势,已被用于研究衰老细胞、神经细胞、血红细胞的氧化损伤模型[5?6]。现已发现,H2O2可诱导MIN6细胞凋亡[7]。本研究中进一步通过AO?EB染色细胞形态学检测及流式细胞技术,证实了氧化剂t?BHP作用后不但MIN6细胞的存活率下降且产生凋亡特征性的形态学改变(核固缩),并且不同剂量的t?BHP引起MIN6细胞不同的损伤表现形式——凋亡或直接引起坏死。
通过比较MTT和流式细胞技术统计图表及数据,笔者发现两种方法在显示细胞存活率上有较大的差异性,表现为相同剂量的t?BHP作用后,流式细胞技术检测的细胞存活率更低，可能是由于MTT实验检测的是线粒体内膜琥珀酸脱氢酶的活脱氢酶仍具有一定活力,仍旧就可以摄取并将黄色MTT还原为蓝色结晶物(甲臜)。有资料表明不同细胞对MTT的敏感性存在差异[8]。由于MTT操作方法简便、、快速、易自动化的优点,被广泛应用于细胞活力和药物毒性筛选方面的研究。另一方面,在细胞存活率时对照组细胞活力设置为100％,其他组存活率为该组的D值与对照组的比值的百分数,而实际上对照组也有一定比例的细胞发生死亡或凋亡。流式细胞技术统计存活细胞是利用Annexin?Ⅴ?PI双染色将细胞分为4个类别,只有Annexin?Ⅴ?FITC和PI都不被染色的才被认为是存活细胞,所以其在原理上更为严格,有其优势。提示MTT可以作为药物对细胞活力的初步筛选,而流式细胞技术可以在此基础上作出进一步的确证。
氧化应激引起的β细胞功能破坏及其数量减少可能是糖尿病发生的重要的病理生理机制。本
研究初步表明,胰腺β细胞能够被氧化物质t?BHP触发而引起β细胞凋亡或坏死,t?BHP诱导MIN6氧化损伤呈量效变化，这对于深入探讨氧化应激引发β细胞损伤的机制提供了一个的良好的、简便的模型。氧化应激可通过多种复杂的信号通路的激活来诱导β细胞损伤,其机制有待深入研究。
【】
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