氯诺昔康对手术致痛大鼠脊髓Fos蛋白表达的影响
【摘要】 目的 研究氯诺昔康对手术致痛大鼠脊髓Fos蛋白表达的影响。 方法 大鼠随机分为7组：注射用水组、氯诺昔康组、手术致痛组及氯诺昔康预处理组4组（分别于致痛前20 min腹腔注射氯诺昔康0.33，1，3，9 mg/kg）。3 h后取出脊髓,免疫组织化学检测Fos免疫反应阳性神经元（FLIN），观察Fos蛋白的表达。 结果 手术致痛组脊髓背角浅层Ⅰ～Ⅱ层Fos蛋白大量表达,氯诺昔康可减少Fos蛋白表达,并呈量效关系。 结论 氯诺昔康对手术致痛引起的脊髓背角Fos蛋白的表达能产生抑制作用,且呈剂量依赖性，同时对手术致痛有镇痛作用。
【关键词】 疼痛； 氯诺昔康； 脊髓； 原癌基因蛋白质c?fos； 免疫组织化学； 疾病模型,动物； 消炎药,非甾类
非甾体类抗炎药氯诺昔康已越来越多用于临床术后镇痛[1]。本文拟研究氯诺昔康对手术致痛大鼠脊髓Fos蛋白表达的影响,评价氯诺昔康对手术致痛的镇痛作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物与分组 健康成年雄性SD大鼠[福建医科大学实验动物中心提供，许可证号:SCXK(闽)2004?0002)]50只,体质量280～320 g,随机分为7组：注射用水组（W组）、氯诺昔康组（L组）、手术致痛组（S组）、4个氯诺昔康预处理手术致痛组（L1S组、L2S组、 L3S组 、L4S组）。其中W组（腹腔注射注射用水1 mL）、L组（腹腔注射氯诺昔康3 mg/kg）、S组（手术致痛未预注氯诺昔康）为对照组,每组6只；L1S组、L2S组、 L3S组 、L4S组为实验组,每组8只,于手术致痛前20 min分别腹腔预注射氯诺昔康0.33,1,3 ,9 mg/kg。
1.1.2 试剂 一抗兔抗c?Fos(4): sc?52,免疫组织化学染色试剂盒为PV9000（北京中杉生物公司）。
1.2 方法
1.2.1 疼痛模型制作 手术致痛参照[2],从足底近端0.5 cm处向趾部作一约1 cm的切口,挑起足底肌肉并纵向切割后缝合皮肤。
1.2.2 脊髓片制备及免疫组织化学分析 手术致痛3 h后,3 %戊巴比妥钠60 mg/kg麻醉下迅速开胸显露心脏,经左心室灌注预冷的4 %多聚甲醛固定,打开椎板,取脊髓L4～L5节断,位置相当于腰膨大中下段。将所取标本置于甲醛固定液中固定,经处理后石蜡包埋切片,切片经抗原修复、封闭非特异抗原、一抗兔抗Fos血清（1∶200）、二抗羊抗兔IgG血清及DAB呈色处理后,在光学显微镜下观察,计数Fos免疫反应阳性神经元（Fos?like immunoreactivity neurons,FLIN）。每次实验均留取数片用PBS或正常羊血清代替一抗做对照实验。
1.2.3 结果判定 免疫组织化学标记显示：FLIN呈圆形或者卵圆形,细胞核呈棕黄色。每只大鼠随机取切片8张,计数每张切片脊髓背角浅层（Ⅰ～Ⅱ层）的FLIN数目,其均数为平均FLIN数目。
1.3 统计学处理 计量数据均以x±s表示,采用SPSS 11.0进行统计分析，组间比较用方差分析,两两比较用Dunnett?t检验,P<0.05为差别有统计学意义。
2 结果
W组和L组未行手术致痛,FLIN极少,2组比较差别无统计学意义（P＞0.05）。S组经过手术致痛,未用氯诺昔康镇痛药,在脊髓L4～L5节断灰质出现大量FLIN,多集中在手术侧脊髓,最多分布在脊髓背角浅层（Ⅰ～Ⅱ层）,其次在深层（Ⅴ～Ⅵ层）,固有核和腹侧灰质也有少量FLIN。L1S组、L2S组、L3S组及L4S组大鼠脊髓灰质背角浅层FLIN数目随氯诺昔康剂量的增大呈减少趋势,且同S组比较差别有统计学意义（P<0.05）（表1，图1）。
3 讨论
3.1 疼痛与脊髓c?fos的表达 自Brennan等提出大鼠切口疼痛模型后[2],文献报道大鼠切口疼痛可使脊髓背角即刻早期基因c?fos原癌基因表达,其产物为Fos蛋白[3]。c?fos原癌基因的表达可作为伤害性刺激的标志物。一定程度上,c?fos被诱导的数量与所受刺激的强度时间及性质而异[4]。
表1 脊髓灰质背角浅层Fos蛋白表达的比较（略）
Tab 1 The expression of Fos in dorsal horn of spinal cord
FLIN:Fos免疫反应阳性神经元. W组：注射用水组；L组：氯诺昔康组；S组：手术致痛组；L1S、L2S、L3S及L4S组为氯诺昔康预处理手术致痛组. 与S组比较,☆：P<0.05；与L1S组比较,#：P<0.05；与L2S组比较,△：P<0.05；与L3S组比较,□：P<0.05.
脊髓背角浅层（Ⅰ～Ⅱ层）的Fos蛋白表达是支配大鼠后爪的C类传入神经纤维兴奋所致,深层（Ⅴ～Ⅵ层）的Fos蛋白表达是由于浅层输入会聚结果,而Ⅲ、Ⅳ层主要是由那些仅对非伤害性刺激做了反应的神经细胞构成。它们的分布与传递外周伤害性信息的初级传入纤维终末的终止部位相一致,也与背角痛敏神经元的分布部位相重叠,表明脊髓背角Fos阳性神经元大都是感觉传递通路上的二级或中间神经元。因此FLIN主要集中在脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层,其次为Ⅴ～Ⅵ层,而Ⅲ～Ⅳ层却很少。
A:注射用水组; B:氯诺昔康组; C:手术致痛组; D:氯诺昔康0.33 mg/kg; E:氯诺昔康1 mg/kg; F:氯诺昔康3 mg/kg; G:氯诺昔康9 mg/kg. A，B:基本无Fos表达; C:可见较多Fos表达; D，E，F，G:随氯诺昔康增加Fos表达减少.
图1 脊髓灰质背角浅层Fos表达情况(×40)（略）
Fig 1 The expression of Fos in dorsal horn of spinal cord
3.2 镇痛药减少疼痛引起的脊髓c?fos表达 Honore等研究发现创伤后3 h FLIN最多[5]。本研究中L组仅行手术致痛，未用镇痛药,与其它组相比,脊髓背角浅层FLIN数目最多,与以上研究结果相似。已有研究显示,预先给予镇痛药吗啡、曲马多等可显著减少各种伤害性刺激所致的脊髓c?Fos表达,如机械性损伤、足底注射甲醛等[3?4]。
既往非甾体类抗炎药较少用于术后疼痛,而近年来研制出的新型非甾体类抗炎药如氯诺昔康等已在临床上越来越多用于术后镇痛,其机制主要是通过作用于环氧化酶抑制可致痛的前列腺素类物质的产生,其次它也能刺激体内产生内源性阿片类物质。在氯诺昔康的镇痛基础研究中,Buritova等将氯诺昔康用于大鼠足底的炎症疼痛模型,表明氯诺昔康有量效关系,随着给药量增加,大鼠足底的肿胀减少,脊髓Fos蛋白表达减少[6]。
本研究采用外科手术致大鼠切口疼痛模型,结果提示随着氯诺昔康剂量增加,脊髓Fos蛋白表达减少,与手术致痛组比较,氯诺昔康（0.33,1,3,9 mg/kg）剂量依赖性减少脊髓背角浅层Fos蛋白表达（22%,45%,69%,82%）,说明氯诺昔康对手术致痛有镇痛作用。
【】
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