雷帕霉素联合卡托普利对大鼠同种异体血管病的作用

            作者：卢衡, 陈良万, 邱罕凡, 黄雪珊  

【摘要】  目的 研究雷帕霉素(RPM)和卡托普利单独或联合用药对大鼠同种异体血管病(CAV)的作用。 方法 建立大鼠同种异体颈动脉移植模型,分别给予蒸馏水、卡托普利、RPM及联合用药（卡托普利+RPM）处理,在移植前和移植后8周查血清NO含量,取组织检测血管内膜厚度,免疫组织化学检测移植动脉中TGF?β1、VCAM?1的表达和PCNA阳性细胞百分率及 CD4+T淋巴细胞的浸润情况。 结果 卡托普利和RPM均可减轻移植动脉血管内膜的增厚程度,联合用药组动脉血管内膜增厚程度最小。各组的血管因子表达情况和CD4＋T细胞的浸润存在差异。 结论 RPM和卡托普利均可延缓移植后CAV的发生、,二者联合用药效果更好。

【关键词】  雷帕霉素; 卡托普利; 心脏移植; 血管疾病; 移植,同种; 疾病模型,动物

　　ABSTRACT:  Objective  To investigate the effects of sirolimus or catopril and their combination on allograft angiopathy in rats.  Methods  The establishment of allograft model was achieved by carotid transplantation in rats.  60 rats were randomly classified into four groups according to being given different medicine: the controlled group(A), catopril?treated group (B), sirolimus?treated group(C) and combination?treated group(D).  At 0, 8 weeks after transplantation the NO content in blood serum were measured and the grafts were harvested for observing the regional changes in the intimal layers by light microscopy and the expression of TGF?β1, VCAM?1, PCNA% and CD4+T cells count in the allograft by immunohistochemistry.  Results  There was a reduced intimal thickness in both catopril?treated group and sirolimus?treated group, especially in the combined treated group.  The number of CD4+T cell infiltration in allograft of group B, group C and group D was less than that of group A(P<0.05).  The NO content in serum of group B and group D was higher than that of group A(P<0.05).  There was weak expression of TGF?β1, VCAM?1 in allograft and lower PCNA(%) in group B, group C and group D than those in group A(P<0.05).  Conclusion  The prevention of catopril and sirolimus on allograft angiopathy is significant and the effect was most obvious when drugs were used combinedly.
  
　　KEY WORDS:  catopril; sirolimus; allograft angiopathy; rats

　　心脏移植后同种异体血管病(CAV)是影响心脏移植病人长期存活的一个主要原因。CAV病变呈现多样性,既有向心性纤维内膜增生的改变,也有类似于普通冠心病的偏心性粥样斑块形成[1]。笔者应用大鼠同种异体颈动脉移植模型,对雷帕霉素(RPM)和ACE?I类药物卡托普利在移植物慢性血管病变中的作用进行研究,报道如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  动物  供体Wistar大鼠[上海斯莱克实验动物有限责任公司,合格证号:SCXK(沪):2003?0003],受体SD大鼠[福建医科大学实验动物中心提供, 合格证号:SCXK(闽):2004?0002],各24只,均为雄性,体质量200～250ｇ。

　　1.1.2  分组  配对移植后受体随机均分成4组(各6只)。蒸馏水组：移植当天经口灌胃蒸馏水;卡托普利组：卡托普利50 mg·kg-1·d-1;RPM组：RPM 3 mg·kg-1·d-1;联合用药组:卡托普利(50 mg·kg-1·d-1)+RPM（1.5 mg·kg-1·d-1）]。给药浓度根据实际体质量调整。

　　1.1.3  药品、试剂及器械  卡托普利(中美上海施贵宝制药有限公司,批号:0503061H);RPM(福建微生物研究所,批号:040301);一氧化氮试剂盒?酶法(深圳晶美生物制品工程有限公司);TGF?β1试剂盒(美国Santa Cruz生物公司);PCNA、VCAM?1试剂盒(美国NeoMarkers公司);鼠抗兔CD4试剂盒(英国Serotec公司);S105酶标仪,BX41双目显微镜,Image?pro Plus机显微摄像系统和JD801形态分析软件(美国捷达科技公司)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  模型建立  供、受体以1％戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。切除受体部分颈总动脉,将供体颈总动脉植入受体颈部, 11?0无损伤丝线间断内膜外翻缝合供、受体颈总动脉的两端(端端吻合),吻合时间＜20 min。移植后1周打开切口观察,动脉通畅为手术成功,血管栓塞为移植失败。

　　1.2.2  受鼠血清提取  分别于移植时和切取标本时抽取静脉血3 mL,离心吸取上层血清0.5 mL查NO的含量。

　　1.2.3  移植物切取和组织学研究  术后第8周切取移植动脉。切取的移植血管固定、包埋、切片,行苏木精染色。每个标本随机取5个不连续切面,计算机显微摄像系统将染色的病理图像输入计算机,JD801形态分析软件分析测量内膜厚度。

　　1.2.4  移植物CD4+T淋巴细胞浸润数计算  以细胞质染成棕黄色、黄色者为阳性细胞,在高倍镜下(×400)连续选取5个视野,网格目镜计数得出每个视野的阳性数,取平均值。

　　1.2.5  免疫组织化学染色法检测移植物转化生长因子?β1（TGF?β1）、血管内皮细胞黏附因子?1（VCAM?1）的表达  光学显微镜观察阳性为细胞质中有棕色、黄色颗粒,测灰度值(JD801形态分析软件测得平均灰度,以灰度值大小与表达多少成反比)。核细胞增殖抗原（PCNA）阳性细胞的表达(阳性细胞核染色为棕褐、棕黄、浅黄色),随机计数500个细胞,以阳性细胞为分子计算PCNA表达指数并用百分比表示。

　　1.3  统计学处理  数据用x±s表示,应用SPSS 11.0统计软件进行方差分析及两两比较,P＜0.05为差别有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  一般情况  实验中无动物死亡,全部移植血管取材时均通畅。

　　2.2  形态学观察  移植后8周:蒸馏水组移植动脉管腔明显变窄,内皮细胞基本覆盖整个管腔,内膜增厚明显,血管壁有多量的炎症细胞浸润;卡托普利组内皮细胞增多,内皮轻度增厚,血管壁各层可见少量炎症细胞;RPM组动脉内膜轻度增厚,各层炎症浸润明显减少;联合用药组内膜未见明显增厚,未见明显的炎症细胞浸润(图1)。

　　A：内膜增厚明显; B：内皮细胞增多,内皮轻度增厚; C：动脉内膜轻度增厚; D：内膜未见明显增厚.

　　图1  移植后8周4组内膜厚度的变化(H?E染色 ×400)（略）

　　Fig 1  The change of endomembrane in the four series of allografts after 8 weeks(H?E staining  ×400)

　　2.3  内膜厚度  移植前内膜厚度为(4.26±0.17)μm,移植后8周蒸馏水组、卡托普利组、RPM组及联合用药组移植物内膜厚度依次为(47.46±3.20),(8.66±1.09),(5.04±0.22)及(4.54±0.10)μm,前3组与移植前比较,P＜0.05,联合用药组P＞0.05;移植后4组两两比较，P＜0.05。

　　2.4  病理组织化学  血清NO含量、血管壁VCAM?1与TGF?β1的表达(平均灰度)、PCNA阳性细胞百分比和CD4+T细胞浸润数见表1。

　　2.5  免疫组织化学表达  移植后8周各组血管壁VCAM?1、TGF?β1、PCNA阳性细胞的表达情况(图2)。蒸馏水组平滑肌细胞和内皮细胞核PCNA阳性表达明显增多,表明平滑肌增殖明显,且有向内膜层生长倾向;联合用药组表达最少,且在内膜层未发现PCNA阳性细胞。

　　表1  4组移植动脉病理组织学检查结果（略）

　　Tab 1  The output of detection in allografts

　　NO：一氧化氮； VCAM?1：血管内皮细胞黏附分子?1； TGF?β1：转化生长因子β1；PCNA：核细胞增殖抗原； RPM：雷帕霉素.  与蒸馏水组比较,☆:P<0.05; 与卡托普利组比较,#:P<0.05.

　　3  讨论
   
　　目前国际上普遍认为CAV发病的主要因素包括了免疫性和非免疫性(再灌注损伤、病毒尤其是巨细胞病毒感染、肥胖、高血压、高脂血症等)因素,在防治CAV时主要采取服用免疫抑制剂方法从而抑制免疫反应和减少非免疫因素。
   
　　根据“损伤反应”理论,移植物血管病变是持续血管损伤产生的结果,这些损伤因素包括免疫反应和一些非特异性损伤[2]。血管内皮的损伤触发了一连串“组织修复”机制引起血管细胞增殖、纤维化及血管重构。NO是抗黏附分子,体外NO供体给药可以抑制VCAM?1的表达,体内给药可抑制中性粒细胞粘附于血管内皮细胞,中性粒细胞黏附于毛细血管的作用可被外源性NO阻断。缺血再灌注损伤是冠状血管内皮细胞功能障碍的起始点,给予L?Arg可以促进NO的生成,减轻缺血再灌注对内皮的损伤,对预防CAV的形成有一定的意义。NO还能抑制血管平滑肌细胞的迁移、增殖,抑制血小板聚集、白细胞的黏附及大量细胞外基质的累积。动物实验与临床研究表明ACE?I类药物有保护血管内皮细胞的作用,能够逆转高血压与高血脂引起的内皮细胞损伤,表现出抗动脉粥样硬化作用[3]。本研究显示,卡托普利能提高血清中NO含量,保护内皮细胞,抑制VCAM?1、TGF?β1的表达,抑制平滑肌细胞的增殖(降低PCNA阳性细胞的百分比),延缓CAV的发生。

　　A:蒸馏水组； B：联合用药组.  NO：一氧化氮；  VCAM?1：血管内皮细胞黏附分子?1； TGF?β1：转化生长因子β1；PCNA：核细胞增殖抗原.

　　图2  移植后8周对照组与联合用药组移植血管免疫组织化学表达(×400)（略）

　　Fig 2  The expression of immunochemistry in allografts on the controlled group and the combinationtreated one groups(×400)

　　RPM作为一种新的免疫抑制剂具有多重功能,在临床应用后,已经证明对急性排斥反应有良好防治效果。研究发现急性排斥反应发生的频率及严重程度和CAV的发病密切相关,而RPM已在动物实验和临床器官移植中被证明能够抑制心脏移植后急性排斥反应[4]。RPM对CAV的防治作用,一部分归功于它对急性排斥反应的抑制作用。RPM强大的抗平滑肌细胞增殖和迁移的特性在防治CAV上也起到非常重要的作用。在CAV的发病过程中,生长因子参与了血管平滑肌细胞损伤后的增殖和迁移,而RPM具有下调大部分生长因子和生长因子受体的表达[5],抑制生长因子(如表皮生长因子和肝细胞生长因子) 的作用。本研究显示,RPM组血管的CD4＋T细胞的浸润数明显少于另两组,说明其有强大的免疫抑制作用,同时明显抑制了TGF?β1的表达,减少内膜中PCNA阳性细胞数,起到抑制平滑肌细胞增殖和迁移的作用。
   
　　本研究提示,卡托普利主要通过增加NO的合成和减少炎症因子起到保护血管内皮细胞的作用,同时具有部分的免疫调节功能;而RPM同时具有强大的抑制免疫反应和抑制生长因子表达的功能。两者合用,可以在抑制免疫反应的同时保护内皮细胞的功能,减低细胞间的反应,抑制血管平滑肌细胞的增殖和移行,从而更好的延缓和减轻移植物血管病变的发生、发展,预防CAV发生。

【】
  　　[1] Rahmani M,Cruz R P,Granville D J,et al. Allograft vasculopathy versus atherosclerosis[J].Circ Res, 2006,99(8):801?815.

　　[2] Crowther M A. Pathogenesis of atherosclerosis[J]. Hematology, 2005,(1):436?441.

　　[3] Chitravas N,Dewey H M,Nicol M B,et al. Is prestroke use of angiotensin?converting enzyme inhibitors associated with better outcome[J]？ Thrift Neurol, 2007,68(20):1687?1693.

　　[4] Radovancevic B,Vrtovec B. Sirolimus therapy in cardiac transplantation[J]. Transplant Proc, 2003,35(3 Suppl):171?176.

　　[5] Oliveira J,Xavier P,Sampaio S,et al. Compared to mycophenolate mofetil, rapamycin induces significant changes on growth factors and growth factor receptors in the early days postkidney transplantation[J]. Transplantation, 2002,73(6):915?920.