加减抵当汤对胰岛素抵抗大鼠肝脏胰岛素受体基因表达的影响

【摘要】  　　［目的］探讨加减抵当汤对IR大鼠肝脏InRmRNA表达的影响。［方法］造模大鼠随机分成正常组、模型组、加减抵当汤高、中、低剂量组、文迪雅组，用RT?PCR方法检测加减抵当汤对IR大鼠肝脏InRmRNA表达的影响。［结果］加减抵当汤高、中剂量组能明显上调IR大鼠肝脏InRmRNA的表达（P<0?05或P<0?01）。［结论］加减抵当汤能上调InRmRNA的表达，可能是其改善IR的机理之一。

【关键词】  抵当汤 胰岛素抵抗 胰岛素受体 基因表达

　　Abstract:［Objective］ To explore the effect of modified Didang decoction on insulin receptor gene expression in liver in insulin resistance rats.［Methods］ The insulin resistance rats were randomly divided into the control group, the model control group, the high, medium and low dosage of modified Didang decoction groups and Wendiya group.Reverse transcriptase polymerase chain reaction was used to observe the effect of modified Didang decoction on the InRmRNA of liver in rats. ［Results］ The InR gene expression level was significantly higher in the high and medium dose of modified Didang decoction（P<0?05 or P<0?01）.［Conclusion］ Up?regulation on InR gene expression is possibly one of the mechanisms of modified Didang decoction in treating insulin resistance.

　　Key words： Didang decoction; insulin resistance; insulin receptor; gene expression
   
　　胰岛素抵抗（Insulin Resistance, IR）是胰岛素作用的靶器官、组织对胰岛素的生物学效应反应降低或丧失而产生的一系列病理和临床表现。本实验通过选用高脂高糖饲料复制IR大鼠模型，用加减抵当汤进行干预，并用西药文迪雅进行对照，观察其相关指标的变化，并从分子水平检测胰岛素受体基因在肝脏中表达的变化，为临床防治IR并阐明其作用机理提供客观依据。

　　1  材料与方法

　　1?1  实验动物及分组  健康雄性SD大鼠60只，体重：208?80±7?29g，购自院上海实验动物中心，由浙江中医药大学动物实验研究中心饲养及管理。60只雄性SD大鼠先适应性饲养1周，再随机分为6组，即正常组10只、模型组10只、加减抵当汤大剂量组10只、中剂量组10只、小剂量组10只、文迪雅对照组10只。正常组给予常规饲料，模型组和中药治疗组给予高脂高糖饮食，各组分别自由饮水。

　　1?2  饲料  基础饲料由浙江省医学科学院提供；高脂高糖饲料由浙江省医学科学院配制，其中基础饲料50%、熟猪油10%、蔗糖25%、蛋黄粉15%。

　　1?3  主要试剂及仪器  葡萄糖试剂盒，甘油三酯试剂盒，胆固醇试剂盒，高密度脂蛋白试剂盒，购自上海申能德赛诊断技术有限公司；低密度脂蛋白试剂盒，购自上海复星长征医学科学有限公司；胰岛素放射免疫分析药盒购自天津九鼎医学生物工程有限公司；RNA抽提试剂盒购自Promega公司；RT?PCR试剂盒购自TAKARA公司；全自动血液流变仪，LBY/Nb北京普利生集团产品；低温冰箱：BCD?216E/B型，青岛海尔电器有限公司产品；凝胶成像分析系统，上海天能科技有限公司产品。PCR循环仪：T personal型， Biometra公司产品。

　　1?4  药物  加减抵当汤组成：酒制大黄9g,桃仁9g,水蛭6g,黄芪20g；以上各药购自浙江中医药大学附属第一，按比例称取后，水煎后浓缩制成每毫升煎液含生药3 g，高温消毒灭菌，置于4℃冰箱保存备用。文迪雅：购自浙江中医药大学附属第一医院，粉碎后溶于0?9%的生理盐水。

　　1?5  使用剂量  根据临床用药情况，折算成大鼠使用剂量。大、中、小剂量分别是成人（60kg）日用药量的20、10、5倍，并稀释成相同的给药容量。对照组文迪雅取成人（60kg）日用药量的10倍，并稀释成相同的给药容量。

　　1?6  处理方法  正常组给予常规饲料同时灌服等容量的生理盐水，模型组和中药组给予高脂高糖饮食，模型组同时灌服等容量的生理盐水，中药组同时灌服大、中、小剂量的加减抵当汤中药煎剂，西药对照组给予文迪雅溶解液，共12周。实验结束后禁食12h，腹主静脉取血并取肝组织用于各项检测。

　　1?7  指标检测  实验结束后，空腹取血，用葡萄糖氧化酶法测葡萄糖（FBS）；放射免疫法测胰岛素（FINS）；各自胰岛素敏感指数ISI=ln［1/(FBS×FINS)］；脂酶法测胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白（HDL?C）、低密度脂蛋白（LDL?C）；全自动血流变仪测定全血比黏度（WBV）、血浆比黏度（PV）；逆转录聚合酶联反应（RT?PCR）检测肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、胰岛素受体（InR）的基因表达。

　　1?8  InRmRNA和PPARγmRNA的表达  (1)组织RNA提取：依照Trizol Reagent使用说明书进行。(2) RT?PCR：按RT?PCR试剂盒中方法操作,设β肌动蛋白基因（β?actin）为内参基因。(3)引物及扩增片段,InR引物:上游：5’?GCTGAGCAACCTTACCAA?3’下游：5’?AAATGTGTACGAACTATC ?3’    扩增产物大小为602bp。PPARγ引物上游：5’?CACAAGAGCTGACCCAATGGTTGCTG?3’下游：5’?CGCAGATCAGCAGACTCTGGGTTC?3’    扩增产物大小为471bp。β?actin上游：5’?GTCACCAACTGGGACGAT?3’下游：5’?GAGGCATACAGGGACAACA?3’    扩增产物大小为209bp。(4)PCR扩增产物分析：PCR产物电泳完毕后在凝胶扫描仪上观察结果，用目的基因光密度值与β?actin光密度值的比值进行半定量分析，得出结果。

　　1?9  统计学方法  本实验数据处理采用SPSS 11?5统计软件。计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析对各组均数进行显著性检验，P<0?05时有统计学意义。

　　2  实验结果

　　2?1  空腹血糖（FBS）、胰岛素（FINS）和胰岛素敏感指数（ISI）  模型组空腹血糖较正常组明显升高（P<0?01）；各药物组与模型组相比，空腹血糖有下降趋势，但无统计学意义。模型组与正常组相比，血清胰岛素水平明显升高（P<0?01），胰岛素敏感指数明显下降（P<0?01），各中药治疗组与模型组相比，中剂量组血清胰岛素下降、胰岛素敏感指数上升最明显（P<0?01），高剂量组次之（P<0?05），低剂量组疗效不显（P>0?05）；文迪雅组与模型组相比，血清胰岛素下降、胰岛素敏感指数上升显著（P<0?01），与中药中剂量组相比无显著差异，见表1。

　　表1  各组大鼠FBS、FINS及ISI情况比较(略)

　　表示与正常组比较,*P<0?01，表示与模型组比较,ΔP<0?05，表示与模型组比较,#P<0?01)

　　2?2  血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL?C）和低密度脂蛋白（LDL?C）  与正常组相比，模型组血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白显著升高（P<0?01）。各中药治疗组与模型组相比，中剂量组血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白显著降低（P<0?01），高剂量组次之（P<0?05），低剂量组和文迪雅组与模型组相比，无统计学意义。各组高密度脂蛋白未见明显差异，见表2。

　　表2  各组大鼠血脂情况比较(略)

　　表示与正常组比较,*P<0?01，表示与模型组比较,ΔP<0?05，表示与模型组比较,#P<0?01

　　2?3  全血比黏度（WBV）和血浆比黏度（PV）  与正常组相比，模型组全血比黏度和血浆比黏度均升高（P<0?01），各中药治疗组与模型组相比，中剂量组全血比黏度和血浆比黏度均降低明显（P<0?01），高剂量组也有降低（P<0?05），低剂量组和文迪雅组与模型组相比无统计学意义，见表3。

　　表3  各组大鼠血液流变学情况比较(略)

　　表示与正常组比较,*P<0?01，表示与模型组比较,ΔP<0?05，表示与模型组比较,#P<0?01

　　2?4  InRmRNA和PPARγmRNA的表达  从肝脏的RT?PCR结果可知，与正常组相比，模型组InRmRNA和PPARγmRNA表达均明显降低（P<0?01），各中药治疗组与模型组相比，中剂量组InRmRNA的表达上升最显著（P<0?01），高剂量组次之（P<0?05），低剂量组无统计学意义，而各中药治疗组PPARγmRNA的表达无明显变化。文迪雅组与模型组相比，InRmRNA的表达无明显变化，而PPARγmRNA的表达有明显升高（P<0?01）。具体见图1-2，表4。

　　表4  各组大鼠肝脏InR和PPARγ与β?actin光密度值比较表(略)

　　表示与正常组比较,*P<0?01，表示与模型组比较,ΔP<0?05，表示与模型组比较,#P<0?01

　　图1  各组大鼠肝脏InRmRNA表达的比较(略)

　　图2  各组大鼠肝脏PPARγmRNA表达的比较(略)
   
　　泳道1-6分别代表Mark、正常组、模型组、加减抵当汤高剂量组、中剂量组、低剂量组、文迪雅组

　　3  讨论

　　高脂高糖饮食致IR动物模型和人类肥胖时的IR病因学相似，由于这一模型具有复制时间短、饲养方便、可靠性高、价格较低等特点［1］，现已广泛应用于IR机理和治疗研究。高脂高糖饮食可以引起多种组织对胰岛素敏感性的降低，主要表现为外周组织对胰岛素刺激的葡萄糖处理能力下降及胰岛素对肝脏葡萄糖输出抑制能力降低［2］。对IR形成过程中的中医证候研究表明，气虚证贯穿IR形成的整个过程，而在IR的后期，以血瘀证等实证为主兼有气虚，且实证的IR程度较虚证为著［3］。因此，本研究以益气活血化瘀立法，通过经方抵当汤去虻虫，加黄芪，组成益气活血化瘀方，方中水蛭直入血络，善能破血逐瘀；桃仁活血化瘀；大黄泻热导瘀；黄芪益气补虚。四味组方，共成益气活血化瘀之剂。对于胰岛素抵抗机理的研究，目前认为主要可分为受体前、受体水平和受体后抵抗。受体前水平，主要指胰岛素基因突变引起的胰岛素一级结构的改变和胰岛素生物活性降低，或胰岛素自身抗体的产生阻断胰岛素的生物活性；受体水平，主要指胰岛素受体基因突变造成的胰岛素受体生物合成减少；胰岛素受体向细胞内表面转运障碍；胰岛素受体降解加速等，均可致细胞表面胰岛素受体数目减少。本实验选择在受体水平研究中药对IR的影响，通过其基因表达的变化来探讨中药改善IR的作用机理。马来酸罗格列酮（商品名文迪雅）属噻唑烷二酮类抗糖尿病药，是PPAR?γ的高选择性、强效激动剂，是目前临床上常用的胰岛素增敏剂，它通过降低胰岛素抵抗，提高胰岛素的敏感性而有效地控制血糖。因此，本实验用文迪雅作为阳性对照药，以比较中药加减抵当汤的疗效及作用机理。通过实验可知，加减抵当汤可有效地改善IR，其中中剂量组的疗效与文迪雅相当，同时，该方能降低血脂，降低血液黏稠度，而文迪雅则不具有该项功能。从RT?PCR的结果来看，加减抵当汤方能有效地上调InRmRNA的表达，而文迪雅则有效地上调PPAR?γmRNA的表达，但对InRmRNA的表达无影响。可见，中药加减抵当汤方改善IR的机理与文迪雅不同，上调InRmRNA的表达可能是加减抵当汤改善IR的机理之一。在中药不同剂量的疗效中，以加减抵当汤中剂量最佳。高剂量时，可能由于药物浓度太高，药液黏稠，影响机体的吸收功能从而影响药效；低剂量时，可能药物浓度过低，致药效不显。

【】
  　　［1］ Storlien LH, Higgins JA, Thomas TC, et al. Diet composition and insulin action in animal models［J］. Br J Nutr, 2000, 83 Supp l:S85?S90.

　　［2］ Schrauwen P, Wagenmakers AJ, van?Marken?Lichtenbelt WD, et al. Increase in fat oxidation on a high?fat diet is accompanied by an increase in triglyceride?derived fatty acid oxidation［J］. Diabetes, 2000, 49(4):640?646.

　　［3］ 钱俊文,柴可夫.胰岛素抵抗模型形成过程的中医证候动态演变研究［J］.中华中医药杂志, 2006,21(7):430?432.