visfatin对大鼠肝脏胆固醇代谢及SREBP?2的调控作用
【摘要】 目的： 探讨visfatin对血浆胆固醇代谢和肝胆固醇合成的影响. 方法： 将空载体转染对照组（NC组）,大鼠visfatin基因真核表达质粒转染普通饲料组（NT组）和高脂组（HT）大鼠，并测定转染前后各组大鼠血浆胆固醇及肝脏HMG CoA还原酶和固醇调节元件结合蛋白 2（SREBP2）mRNA表达的变化. 结果： visfatin质粒注射3 d后，NT和HT组大鼠血浆胆固醇均较注射前明显下降［（1.61±0.18） vs（1.25±0.09）mmol/L和（2.37±0.11）vs（1.74±0.12）mmol/L，均P<0.05］；高密度脂蛋白胆固醇(HDL?C)也明显降低［（0.83±0.09）vs（0.56±0.09）mmol/L 和（1.32±0.09） vs （0.91±0.04）mmol/L, P<0.05］；NT和HT组大鼠SREBP2 mRNA表达均明显高于NC组［(0.37±0.06)，（0.36±0.07） vs （0.21±0.04），均 P<0.05］, NT组HMG CoA还原酶mRNA水平明显高于NC，HT组［（0.89±0.13） vs （0.37±0.07）和（0.55±0.16）, 均P＜0.05］，NC组与HT组无明显差异. 结论： visfatin可能通过促进SREBP2和HMG CoA还原酶表达来调节体内胆固醇代谢.
【关键词】 内脂素 胆固醇 HMG CoA还原酶 固醇调节元件结合蛋白 2
0引言
visfatin又称前B细胞克隆增强因子(PBEF)，是最近发现的一种脂肪细胞因子,也称为内脂素. 研究表明，visfatin具有类胰岛素作用，能够促进脂肪的合成与聚集［1- 2］. 目前的研究大多集中在visfatin与2型糖尿病、胰岛素抵抗、肥胖的关系，但其与胆固醇代谢的关系目前并不清楚. 固醇调节元件结合蛋白(SREBP?2)与羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMG CoA还原酶）是主要的胆固醇生物合成通路的调控元件，与胆固醇代谢密切相关. 因此，我们通过构建大鼠visfatin基因重组真核表达质粒并导入大鼠体内，探讨visfatin过表达对肝SREBP?2与HMG CoA还原酶表达的影响，从而分析其对胆固醇代谢的调节作用.
1材料和方法
1.1材料去内毒素质粒大量提取试剂盒（Omega公司）；Trizol（Invitrogen公司）；反转录酶M?MLV，Taq DNA聚合酶（TaKaRa公司）；羊抗鼠visfatin多克隆抗体（Santa Cruz公司）；HRP标记的兔抗羊二抗（中杉金桥公司）；化学发光试剂盒（康成生物公司）；DYY?III稳压稳流电泳仪、双垂直板蛋白电泳槽（北京六一仪器厂）；半干转印迹电转系统，BIO?RAD Gradient Cycler PCR仪（Bio?rad）；日立7020型全自动生化分析仪；SD雄性大鼠15只（第三军医大学大坪实验动物中心）.
1.2方法
1.2.1pcDNA3.1?visfatin重组真核表达质粒的构建本课题组前期构建，经DNA测序鉴定，导入基因无突变，构建成功.
1.2.2动物分组及处理将大鼠15只随机分为正常饮食pcDNA3.1(+)空质粒注射组（NC组, n=5）、正常饮食pcDNA3.1?visfatin重组真核表达质粒注射组（NT组, n=5）和高脂饮食pcDNA3.1?visfatin重组真核表达质粒注射组（HT组, n=5）. 各组大鼠喂养16 wk. 高脂饲料组成为：蛋白质12%，脂肪54%，碳水化合物34%. 用空载及表达质粒注射于大鼠股四头肌，1 mg/kg. 于注射前后72 h各取其空腹血，分离血浆，于第2次取血后处死大鼠取肝脏组织.
1.2.3HMG CoA还原酶和SREBP?2表达测定用常规方法提取大鼠肝组织总RNA，用逆转录聚合酶链反应（RT?PCR）半定量测定肝HMG CoA还原酶和 SREBP2 mRNA，以β?actin为内参. HMG CoA还原酶上游引物为：5′?CCTGCGTGTCCCTGGTCCTA? 3′；下游引物：5′?CTTTGGGTTACTGGGTTTGG? 3′. SREBP?2上游引物：5′?GGCTCTGGCCGCAATGTA? 3′；下游引物：5′?TGACCGAGGAGCGTGAGT? 3′. β?actin上游引物：5′? CCACTGCC GCATCCTCTTCCTC? 3′；下游引物：5′? TCCTGCTTGCTGATCCACATCT? 3′.
1.2.4其他指标测定采用Western Blot法测定血浆visfatin水平；血浆总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL?C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL?C）在全自动生化分析仪进行测定.
统计学处理：各项数据资料以x±s表示，组内比较采用配对t检验，组间比较用方差分析，多组间两两比较用Student?Newman?Keuls检验，数据处理采用SAS8.0软件.
2结果
2.1血浆visfatin水平变化质粒注射后NT，HT组血浆visfatin水平较注射前均升高［（1.59±0.04） vs（1.04±0.15）和(1.90±0.12) vs (1.04±0.15), 均P<0.05 ］, 而NC组在注射前后无明显差异（图1）.
1,3,5: 质粒注射前血浆visfatin ； 2,4,6: 质粒注射后血浆visfatin; NC组：正常饮食pcDNA3.1(+)空质粒注射组； NT组：正常饮食pcDNA3.1?visfatin重组真核表达质粒注射组； HT组：高脂饮食pcDNA3.1?visfatin重组真核表达质粒注射组.
图 13组大鼠血浆visfatin蛋白水平Western Blot检测（略）
2.2血浆胆固醇变化HT组基础血浆TC，HDL?C，LDL?C水平均明显高于NC，NT组（P＜0.05）. 质粒注射后NT，HT组血浆TC，HDL?C均明显降低（P＜0.05），HT组LDL?C也明显降低（P＜0.05）；而NC组TC，HDL?C，LDL?C在质粒注射前后无明显差异（表1）.
表 1visfatin质粒处理前后胆固醇代谢相关的实验室指标变化（略）
aP<0.05 vs 注射前；cP<0.05 vs NC组. NC组：正常饮食pcDNA3.1(+)空质粒注射组；NT组：正常饮食pcDNA3.1?visfatin重组真核表达质粒注射组；HT组：高脂饮食pcDNA3.1?visfatin重组真核表达质粒注射组.
2.3HMG CoA还原酶和SREBP2 mRNA变化NT组HMG CoA还原酶mRNA水平明显高于NC，HT组（P＜0.05），NC组与HT组无明显差异. NT组与HT组SREBP?2 mRNA水平均明显高于NC组（P＜0.05），NT组与HT组之间无显著差异（表2）.
表2visfatin质粒处理对大鼠肝脏HMG CoA还原酶、SREBP?2 mRNA表达量的影响（略）
aP<0.05 vs NC组. NC组：正常饮食pcDNA3.1(+)空质粒注射组；NT组：正常饮食pcDNA3.1?visfatin重组真核表达质粒注射组；HT组：高脂饮食pcDNA3.1?visfatin重组真核表达质粒注射组.
M：DL2000 DNA ladder marker；NC组：正常饮食pcDNA3.1(+)空质粒注射组；NT组：正常饮食pcDNA3.1?visfatin重组真核表达质粒注射组；HT组：高脂饮食pcDNA3.1?visfatin重组真核表达质粒注射组.
图2肝脏HMG CoA还原酶基因表达变化（略）
M：DL2000 DNA ladder marker；NC组：正常饮食pcDNA3.1(+)空质粒注射组；NT组：正常饮食pcDNA3.1?visfatin重组真核表达质粒注射组；HT组：高脂饮食pcDNA3.1?visfatin重组真核表达质粒注射组.
图3肝脏SREBP?2基因表达（略）
3讨论
Visfatin能与胰岛素受体结合并具有类胰岛素作用，改善胰岛素抵抗，促进脂肪细胞分化等［2，3-4］，但其与胆固醇代谢的关系目前并不清楚. 我们在早期的临床研究中发现HDL?C是影响血浆visfatin水平的独立相关因素［5］，提示visfatin可能与胆固醇代谢有关. 我们的结果表明，在pcDNA3.1?visfatin注射后3 d，大鼠血浆visfatin水平明显升高，说明visfatin基因在大鼠体内能有效的高表达；NT和HT两组大鼠血浆TC和HDL?C水平均显著下降，这与关于人血浆visfatin与HDL呈正相关的研究结果不一致［6］，这可能与实验对象及实验条件不同有关，但至少可推断在人和动物中，visfatin水平的变化与机体胆固醇代谢明显有关. 在本研究中，visfatin质粒转染后LDL?C显著降低，提示visfatin也促进了LDL?C的代谢，使其水平降低，鉴于LDL?C在动脉粥样硬化的形成中的重要作用，我们推测visfatin在调节胆固醇代谢的信号通路和抑制动脉粥样硬化形成方面可能具有重要作用.
SREBPs是一种存在于内质网的参与调节细胞胆固醇代谢的条件转录激活因子，介导胆固醇生物合成的反馈调节，其转录活性依赖于细胞膜胆固醇状态调控细胞胆固醇代谢；当细胞膜胆固醇含量降低的时候，其表达增加进而促进HMG CoA还原酶、LDL受体等靶基因的表达，从而升高细胞内胆固醇水平，达到对细胞内胆固醇水平的有效调控［7-9］. 我们的研究发现，visfatin质粒转染后，大鼠SREBP2 mRNA及HMG CoA还原酶mRNA的表达均明显升高，提示血浆visfatin能上调HMG CoA还原酶和SREBP?2的表达，从而促进肝脏胆固醇代谢，降低血浆总胆固醇水平.
我们的实验结果中，HT组大鼠HMG CoA还原酶mRNA的表达低于NT组，这可能是因为HT组大鼠摄入了大量的外源性胆固醇，其对HMG CoA还原酶具有抑制作用，尽管visfatin质粒转染后HMG CoA还原酶表达有一定程度的升高，但仍低于NT组大鼠. 然而，两visfatin处理组间SREBP?2表达无明显差异，这主要因为SREBP?2只有与固醇结合元件结合蛋白激活蛋白结合后，释放出活性氨基末端，才发挥其促进胆固醇代谢的作用，外源性胆固醇可能对其mRNA的表达没有影响，仅对其下游产物如HMG CoA还原酶等产生抑制作用.
总之，研究结果显示visfatin 对机体胆固醇代谢具有调节作用，能促进肝脏胆固醇代谢，从而降低血浆总胆固醇水平，但其影响胆固醇代谢的信号通路和具体的作用环节尚需进一步研究.
【】
［1］ Stephens JM，Vidal?Puig AJ. An update on visfatin/pre?B cell colony?enhancing factor,an ubiquitously expressed, illusive cytokine that is regulated in obesity［J］. Curr Opin Lipidol， 2006，17(2):128-131.
［2］ Fukuhara A, Matsuda M, Nishizawa M, et a1. Visfatin：A protein secreted by visceral fat that mimics the ffects of insulin［J］. Science, 2005, 307: 426-430.
［3］ Pagano C, Pilon C, Olivieri M ，et al. Reduced plasma visfatin/pre?B cell colony?enhancing factor in obesity is not related to insulin resistance in humans［J］. J Clin Endocrinol Metab， 2006, 91:3165-3170.
［4］ Dogru T, Sonmez A, Tasci I， et al. Plasma visfatin levels in patients with newly diagnosed and untreated type 2 diabetes mellitus and impaired glucose tolerance［J］. Diabetes Res Clin Pract， 2007, 76:24-29.
［5］ 杨媚，杨刚毅，李伶，等. 不同糖耐量个体血浆内脂素水平的变化［J］. 中华内分泌代谢杂志,2006，22：245-247.
［6］ Wang P, van Greevenbroek MM, Bouwman FG, et al. The circulating PBEF/NAMPT/visfatin level is associated with a beneficial blood lipid profile［J］.Pflugers Arch, 2007,454(6):971-976.
［7］ Brown MS，Goldstein JL．A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of memb ranes，cells，and blood.［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，1999，96(20)：1104l-11048.
［8］ Adams CM，Reitz J，De Brabander JK， et a1 ．Cholesterol and 25?hydr0xych 0lester0l inhibit activation of SREBPs by different mechanisms，both involving SCAP and Insigs［J］．Biol Chem，2004，279(50)：52772-52780．
［9］ Radhakrishnan A，Sun LP，Kwon HJ，et a1．Direct binding of cholesterol to the purified memb rane region of SCAP：mechanism for a sterol?sensing domain［J］．Mol Cell，2004，15：259-268．
