SCID小鼠耳廓皮下滑膜移植模型的建立及其在英夫利昔疗效评估中的应用
【摘要】 目的： 建立一种简便、可靠、易于给药及观察的小鼠荷人类风湿关节炎（RA）滑膜模型，为抗RA药物疗效及其机制的体内研究提供实验系统.方法： 无菌获取4例RA患者膝关节滑膜组织，修剪成3 mm3大小，移植入严重联合免疫缺陷小鼠（SCID）耳廓皮下，同时以2例OA滑膜作为对照.移植入4 wk后开始，给予TNF?α mAb体英夫利昔4 wk，以无关抗人IgG1抗体作为对照. 隔日观察，根据移植物红肿程度对炎症进行评分. 移植入8 wk后，处死小鼠取出移植物，进行苏木素?伊红（HE）染色病理分析.结果： 人滑膜在SCID小鼠体内存活至少8 wk，移植后RA滑膜炎症大体评分高于OA滑膜组（P<0.05）；移植前后RA滑膜病理特点无明显变化，经局部注射TNF?α抗体治疗后炎症评分降低（P<0.05），病理检测示滑膜增殖及淋巴细胞浸润评分降低（P<0.05）.结论： SCID?HuRAg模型的病理特点与RA患者体内类似；经局部注射生物靶向药物英夫利昔后有相应改善，是对RA滑膜炎症机制进行体内研究的一种简便实用模型.
【关键词】 关节炎 类风湿 联合免疫缺陷小鼠 模型 动物 滑膜炎
0引言
关节炎动物模型在阐明各种关节炎症的发病机理中起着重要作用.佐剂性关节炎、胶原诱导性关节炎模型及各种遗传缺陷的自发性关节炎模型一直是研究类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)滑膜炎症的重要工具，但均与RA患者体内的滑膜病变不完全相似.传统的严重联合免疫缺陷小鼠（SCID）荷人RA滑膜模型（SCID?HuRAg）多采用肾包囊移植，操作难度较大［1］，在实际应用中存在着一定的限制. 我们拟建立一种简便、可靠、易于给药及观察的（SCID）小鼠荷人RA滑膜（SCID?HuRAg）模型.
1材料和方法
1.1材料15只SCID小鼠由院上海斯莱克动物有限责任公司提供，鼠龄4～6 wk，雄性，体质量12～15 g. 在无菌层流环境中（IVC?Ⅱ型独立送风隔离笼具系统，苏州冯氏实验动物有限公司）饲养.饲料、饮水及垫料均经过灭菌处理.术前测定SCID小鼠血常规，剔除白细胞＞3×109/L(可能存在“渗漏”）的小鼠［2］.无菌获取4例RA及2例OA膝关节滑膜，标本取自我科膝关节镜滑膜清理术患者.RA患者诊断符合1987年美国风湿病学会（ACR）修订的RA分类标准，OA患者诊断符合1986年ACR制定的OA分类标准.英夫利昔（TNF?α mAb，商品名类克，美国Centocor公司生产、西安杨森公司提供）；抗人IgG1（第四军医大学微生物教研室提供）.速眠新Ⅱ号注射液（解放军军需大学兽医研究所研制）.
1.2方法
1.2.1标本准备及处理无菌条件下获取RA及OA患者滑膜，保存于无菌4℃达氏修正依氏培养基（DMEM）中备用.超净台内修剪成3 mm3的组织块，移至预加入DMEM培养液的24孔板中，4℃保持至移植.自滑膜切除到移植的间隔时间为2～3 h.
1.2.2移植方法速眠新Ⅱ号注射液，1∶50稀释，0.4 mL/只，腹腔麻醉， 在层流超净台中无菌操作.于双耳耳廓背侧基底做一个3 mm切口，用眼科镊插入切口在皮下钝性分离一4 mm×4 mm潜在腔隙，将修剪好的滑膜植入，不缝合.移植8 wk后处死所有荷RA或OA滑膜小鼠并取出移植物，采用40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，经常规HE染色后进行组织病分析.15只SCID小鼠中，5只移植OA滑膜，10只移植RA滑膜.
1.2.3英夫利昔治疗试验及分组移植4 wk后，将10只移植RA滑膜的RA?SCIDHug小鼠随机分为2组（n=5），分别于移植物周围局部皮下注射英夫利昔及抗人IgG1抗体，100 μg/(40 μL·只)，每周2次［3］.治疗4 wk后处死小鼠，取出移植物，标本处理及检查同1.2.2.
1.2.4一般情况观察及滑膜炎症大体评分标准隔日观察一次SCID小鼠一般情况，体质量变化.根据耳廓移植物红肿范围、严重程度进行0～3分的滑膜炎症指数（Synovitis Clinical Score，SCS）盲法评分.其标准为：3分为明显红肿；2分为中度红肿；1分为轻度红肿；0分为无红肿.
1.2.5滑膜炎症病理评分标准对滑膜炎性病理改变进行盲法评分，并对滑膜增生、淋巴细胞浸润及新生血管分别进行0～3分半定量评分.其标准为：3分为对照小鼠的病理改变，2分为比对照小鼠较轻的表现，1分为最轻的改变，0分为无明显改变.
统计学处理：采用SPSS10.0软件进行统计分析. 组间等级资料的比较采用非参数检验(Mann?Whitney U检验). P<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1移植后小鼠一般情况全部小鼠无感染及意外死亡，体质量无明显变化（P>0.05），活动状态良好.肉眼观察手术切口于移植后2 d基本愈合（无需缝合），未见移植物坏死表现.
2.2滑膜炎症评分 大体观察RA滑膜，红肿较OA滑膜明显. RA滑膜移植组较OA滑膜移植组的滑膜炎症评分高(P<0.05， 图1).
aP<0.05 vs OA滑膜移植组.
图1RA与OA滑膜移植后滑膜炎症评分比较（略）
2.3RA滑膜移植前后移植物病改变RA滑膜移植前后病理学改变相似，均可见炎细胞浸润、滑膜增生及新生血管等表现(图2).
A：移植前； B：移植后.
图2RA滑膜移植前后病理评分比较HE ×40（略）
2.4英夫利昔RA?SCIDHug的效果观察
2.4.1大体形态及评分与对照组相比，经英夫利昔治疗后移植物红肿明显减轻，滑膜炎症评分显著降低(P<0.05，图3，4）.
2.4.2病理评分英夫利昔治疗组与对照组进行病理分析，其滑膜增生、淋巴细胞浸润程度明显减轻(P<0.05，图5)， 新生血管减少，但无统计学差异.
A：对照抗体组； B：英夫利昔治疗组.
图3治疗组与对照组大体形态比较（略）
aP<0.01 vs 对照抗体组.
图4治疗组与对照组滑膜炎症评分比较（略）
aP<0.05 vs 对照抗体组.
图5英夫利昔治疗SCIDHuRAg后炎症病理改变（略）
3讨论
SCID?HuRAg的建立及应用使体内直接研究人RA滑膜炎症的病理机制及客观评价治疗措施的愿望成为现实［1］.本实验表明，SCID小鼠耳廓皮下滑膜移植的方法，创伤小，恢复快，较肾包囊移植在时间、可操作性上具有较大优势；耳廓皮下移植RA滑膜的病理特点与人体RA滑膜相似，且能够反映局部注射药物所引起的相应变化，是体内研究RA发病机制和开发评价新药的可靠平台.
此前，其他研究已经显示，人正常滑膜及RA的炎性滑膜能在SCID小鼠体内存活. Brinckerhoff等将分离培养的RA滑膜细胞注射到裸鼠皮下证实了人FLS和血管翳样组织能存活近30 d. 也有学者将RA滑膜直接移植到SCID小鼠的膝关节腔中，其中表达人CD68的细胞能维持8 wk，但所形成的血管翳组织及鼠软骨和骨的破坏主要系由鼠来源的细胞所介导. 最为典型的模型是肾包囊移植所建立的模型， Geiler等［4］将RA滑膜以及正常的人软骨共同移植到SCID小鼠体内观察到了软骨中血管翳样组织的形成. 但传统的肾包囊移植SCID?HuRAg存在操作难度大，且不能直接给药，无法肉眼观察等缺陷［1-2］.
我们通过改变移植部位，提高了建模的成功率，缩短了操作时间，减轻了对动物的创伤. 并胶原诱导性关节炎动物模型的关节炎评分标准制定了移植滑膜的炎症评分标准（Synovitis Clinical Score，SCS），能在一定程度上反映滑膜炎症程度，为观察药物疗效提供了新的指标. 本实验中英夫利昔治疗后滑膜增生及淋巴细胞浸润明显减轻，但血管新生未见明显抑制，可能与头颈部血供丰富有关.
近年来，以英夫利昔为代表的TNF?α拮抗剂揭开了RA生物治疗的新篇章［5-6］，但并非对所有RA患者都有效［7］.实际上，关于TNF的体内作用方式以及影响及其治疗效果的因素等许多问题，仍存在着争论和疑惑［6］，需要进一步在体内进行机制的研究和疗效的评估.此外，还有很多新的靶点在RA发病机制中的作用及其靶向性治疗的研究正在进行［8］.SCID?HuRAg耳廓皮下移植模型平台的建立将在新型生物制剂的开发和效果评价中发挥更大的作用.
【参考】
［1］ Matsuno H, Yudoh K, Uzuki M, et al. The SCID?HuRAg mouse as a model for rheumatoid arthritis［J］. Mod Rheumatol, 2001,11(11):6-9.
［2］ 史战国, 朱平, 贾俊峰,等. 类风湿关节炎滑膜侵蚀软骨SCID鼠模型的建立及初步实验研究［J］. 中华风湿病学杂志, 2006,(08): 466-469.
［3］ Matsuno H, Yudoh K, Katayama R, et al. The role of TNF?alpha in the pathogenesis of inflammation and joint destruction in rheumatoid arthritis(RA): a study using a human RA/SCID mouse chimera［J］. Rheumatology(Oxford), 2002,41(3):329-337.
［4］ Geiler T, Kriegsmann J, Keyszer GM, et al. A new model for rheumatoid arthritis generated by engraftment of rheumatoid synovial tissue and normal human cartilage into SCID mice［J］. Arthritis Rheum, 1994,37(11):1664-1671.
［5］ Lin J, Ziring D, Desai S, et al. TNFalpha blockade in human diseases: an overview of efficacy and safety［J］. Clin Immunol, 2008,126(1):13-30.
［6］ Wong M, Ziring D, Korin Y, et al. TNFalpha blockade in human diseases: Mechanisms and future directions［J］. Clin Immunol, 2008,126(2):121-136.
［7］ Williams RO, Paleolog E,Feldmann M. Cytokine inhibitors in rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases［J］. Curr Opin Pharmacol, 2007,7(4):412-417.
［8］ Tarner IH, Muller?Ladner U,Gay S. Emerging targets of biologic therapies for rheumatoid arthritis［J］. Nat Clin Pract Rheumatol, 2007,3(6):336-345.
