维生素D3联合地塞米松对哮喘大鼠的治疗作用及机制

【摘要】  目的: 探讨维生素D3联合地塞米松对哮喘大鼠的作用及其机制. 方法： 实验分为正常对照组（A组）、哮喘模型组(B组)、地塞米松组（C组）和维生素D3联合地塞米松治疗组(D组)，每组Wister大鼠10只. 用卵白蛋白（OVA）腹腔注射致敏和雾化吸入激发建立哮喘大鼠模型，采用ELISA方法测定大鼠血清中IgE，IL?4，IL?5含量；收集肺泡灌洗液（BALF）进行细胞计数和分类. 结果： ①大鼠血清IgE，IL?4，IL?5含量B组分别为（362.84±6.26 ）×103 IU/L，（22.66±1.59） ng/L，和（55.31±2.81） ng/L， A组分别为(36.16±2.61)×103IU/L，(8.37±0.66) ng/L，(13.45±1.70) ng/L，B组和A组相比较，差异具有统计学意义（P<0.05）；C组分别为(188.25±5.55)×103IU/L，(6.23±0.90) ng/L，(29.64±1.90) ng/L，D组分别为（114.47±6.00）×103IU/L，(2.06±1.30) ng/L，(7.33±1.33) ng/L，C和D组与B组相比均显著降低（P<0.05）；D组与C组相比也显著降低（P<0.05）；②大鼠BALF中细胞总数及各种炎症细胞B组较A组增加；C组和D组比B组明显减少（P<0.05），且D组与C组相比亦明显减少，差异具有统计学意义（P<0.05）. 结论： 维生素D3联合地塞米松能够有效地治疗哮喘，其机制可能是通过协同抑哮喘大鼠气道炎性反应和降低哮喘大鼠血清中IgE，IL?4，IL?5水平实现的.

【关键词】  支气管哮喘 地塞米 维生素D3 免疫球蛋白 白细胞介素4 白细胞介素5

　　0引言

　　支气管哮喘是一种变态反应性疾病，血清IgE,IL?4,IL?5在其发病机制中占有重要地位［1］. 近年来，有研究［2］表明1,25?(OH)2 ?D3参与了哮喘的免疫调节. 本实验通过复制哮喘大鼠模型，尝试用1,25?(OH)?D3联合地塞米松进行治疗，观察1,25?(OH)2 ?D3联合地塞米松对哮喘大鼠血清IgE，IL?4，IL?5含量及支气管肺泡灌洗液中细胞总数及各种炎症细胞数量的影响，以探讨1,25?(OH)2 ?D3联合地塞米松治疗哮喘的可能作用机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料健康雄性Wister大鼠40只，4～6 wk龄，体质量（200±20）g（沈阳军区总动物实验中心）；地塞米松（浙江仙琚制药股份有限公司）；卵白蛋白(OVA）（美国SIGMA公司）；1,25?(OH)2 ?D3（Calbiochem?Novabioche公司）；ELISA试剂盒（武汉博士德生物有限公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1实验分组随机将大鼠分为：正常对照组（A组），哮喘模型组(B组)，地塞米松组（C组），维生素D3联合地塞米松治疗组(D组)，每组10只.

　　1.2.2哮喘模型建立参照［3］的方法制备哮喘动物模型.  第1日：B、C、D各组大鼠用1mL致敏液（含OVA10 mg，灭活百日咳疫苗5×109个，氢氧化铝凝胶100 mg ）腹腔注射致敏；第8日：重复致敏1次；第15日开始B，C和D组大鼠置于密闭玻璃罩中以OVA雾化吸入诱喘，每次约20 min，每天诱喘1次，共3 d. 雾化时大鼠出现打喷嚏、呼吸急促、尿便失禁等症状，说明哮喘模型复制成功. A组在相同时间腹腔注射、雾化吸入等量生理盐水. A组和B组于激发前1 h给予生理盐水1 mg/kg腹腔注射，连续3 d；C组于每次激发前1 h给予地塞米松1 mg/kg腹腔注射进行干预，连续3 d；D组给予地塞米松1 mg/kg并参照文献［4-5］的剂量给予1,25?(OH)2 ?D3 5×105 U/kg腹腔注射，连续3 d.

　　1.2.3血清IgE，IL?4和IL?5含量测定哮喘大鼠经麻醉后腹主动脉取血，于4℃静置30 min后，以1500 r/min 离心15 min，收集上层血清，采用ELISA法测定血清IgE，IL?4和IL?5的含量，实验操作步骤参照试剂盒说明书进行.

　　1.2.4支气管肺泡灌洗及BALF细胞分离与计数各组大鼠腹腔麻醉后结扎右侧主支气管，进行气管插管，行左肺肺泡灌洗术. 缓慢注入生理盐水5 mL，停留10 s，缓慢回抽，重复6次，回收液立即注入离心管中，4℃，1200 r/min 离心10 min. 取适量沉淀做细胞涂片，HE染色，至少计数200个细胞作细胞分类计数.

　　1.2.5肺组织HE染色各组大鼠于最后一次激发后24 h内处死，立即取大鼠肺组织用酒精脱水，石蜡包埋切片，厚度为3 μm，HE染色，光镜下观察各级支气管、肺泡、肺泡隔炎性细胞浸润情况.

　　统计学处理：数据处理采用SPSS13.0 统计软件，所有计量资料均以x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析及LSD?t 检验，组间方差不齐时，采用秩和检验. P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1支气管BALF中细胞计数与分类大鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数及各种炎症细胞B组较A组显著增加（P<0.05，表1)，主要由巨嗜细胞、嗜酸粒细胞构成. 支气管肺泡灌洗液中细胞总数及嗜酸粒细胞C组和D组较B组显著下降（P<0.05)， D组与C组比较下降更为显著，差异具有统计学意义（P<0.05).

　　表1BALF细胞计数及分类（略）

　　aP<0.05 vs A； cP<0.05 vs B； eP<0.05 vs； C.  A：正常对照组；B：哮喘模型组；C: 地塞米松组；D： 维生素D3合并地塞米松组.

　　2.2大鼠血清IgE,IL?4,IL?5含量变化大鼠血清IgE,IL?4和IL?5含量B组与A组相比较均显著增高（P<0.05）， D组和C组较B组显著降低（P<0.05），D组含量降低更为显著，与C组相比差异具有统计学意义（P<0.05，表2）. 

　　表2各组大鼠血清中IgE,IL?4,IL?5水平比较（略）

　　aP<0.05 vs A； cP<0.05 vs B； eP<0.05 vs C. A：正常对照组；B：哮喘模型组；C: 地塞米松组；D：维生素D3合并地塞米松治疗组.

　　2.3肺组织形态学改变光镜下观察结果显示，A组大鼠气道上皮完整，粘膜光滑，无纤毛脱落，肺泡腔内未见炎性渗出，黏膜下未见炎细胞浸润，气管平滑肌无增厚. B组支气管壁及支气管周围组织有多处红细胞聚集区，且有大量炎细胞浸润，包括淋巴细胞、嗜酸粒细胞、单核细胞等；气道黏膜上皮增厚，气道变窄，严重者可见脱落.  D组小气道及肺泡壁结构完整，支气管和肺泡腔内分泌物以及肺组织炎性细胞浸润明显减少，无气道狭窄及气道上皮细胞脱落等现象. C组病理表现与D组相似，但炎性细胞减少较D组弱(图1).

　　A：正常对照组； B：哮喘模型组； C：地塞米松治疗组； D：维生素D3联合地塞米松治疗组.

　　图1各组大鼠肺组织病理改变HE ×100（略）

　　3讨论

　　支气管哮喘是嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞及其细胞成分参与的气道慢性炎症性疾病. T淋巴细胞Th1 /Th2失衡及Th2细胞功能亢进是哮喘等过敏性疾病的免疫基础. 目前糖皮质激素仍是临床应用最普遍的抗哮喘药物由于长期应用激素副作用较大，因此，寻找有效抑制支气管哮喘粘膜慢性炎症的药物与糖皮质激素联合应用，是当前研究的热点.

　　近年来1,25?(OH)2?D3 受到广泛关注，它是维生素D 的活性形式，除了调节机体钙、磷代谢的动态平衡外，还参与机体免疫系统的分化和调节. 研究［7］证实，1,25?(OH)2?D3 是一种新的神经内分泌?免疫调节激素，它在T 细胞及单核细胞水平均能影响细胞因子的分泌，并对Th1，Th2型细胞因子产生不同的调节效应，选择性抑制Th1 型细胞因子，从而改善HT的Th1 与Th2 细胞因子失衡，显示了其对Th1，Th2 型细胞因子分泌的严密而精细的调节作用. 1,25?(OH)2 ?D3至少能在T细胞和单核细胞两个水平影响细胞因子分泌，并能对TH1、TH2型细胞因子产生不同的效应.

　　本研究结果发现，经维生素D3联合地塞米松治疗后大鼠气道内嗜酸粒细胞较哮喘组明显减少，提示维生素D3联合地塞米松能有效地控制哮喘气道炎症，可能的原因是由于嗜酸粒细胞的减少从而减少，其所释放的一系列炎性介质和细胞因子如LTB4,LTC4,LTD4及PAF等，在哮喘的发病机制中产生重要的作用.

　　本实验结果显示，维生素D3联合地塞米松可降低哮喘大鼠气道内炎症和大鼠血清中IL?4，IL?5和IgE的水平；维生素D3与糖皮质激素联合作用的效果优于单独应用糖皮质激素，从多途径，多环节上更好地控制气道炎症及炎性介质和细胞因子如IL?4,IL?5的释放，从而达到治疗哮喘的目的.

　　综上所述，维生素D3联合地塞米松对哮喘发作有明显保护作用，为预防和治疗哮喘发作,提供了一种可能的方法，其作用机制值得进一步探讨.

【】
  　　［1］ 刘春涛. 气道炎症性疾病 ［M］. 北京：人民卫生出版社，2004：506-507.

　　［2］ Topilski L, Flaishon L, Naveh Y, et al. The anti?inflammatory effects of 1,25?dihydroxyvitamin D3 on Th2 cells in vivo are due in part to the control of integrin?mediatedT lymphocyte homing［J］.Eur J Immunol,2004,34:1068-1076.

　　［3］ 王鲁宁,孔灵菲,刘玉琪. 地塞米松对哮喘豚鼠气道壁厚度的影响［J］. 病理生理杂志, 2002, 18(5):564 - 565.

　　［4］ Cantorna MT, Munsick C, Bemiss C, et al.1,25?Dihydroxycholecalciferol prevents and ameliorates symptoms of experimental murine inflammatory bowel disease［J］. J Nutr, 2000,130:2648-2652.

　　［5］ Matheu V, Back O，Mondoc E，et al. Dual effects of vitamin D?induced alteration of TH1/TH2 cytokine expression：Enhancing IgE production and decreasing airway eosinophilia in murine allergic airway disease［J］. J AIlergy Clin Immunol, 2003, 112:585-592.

　　［6］ 王岷, 吴大玮, 王君, 等. 核因子κB 和Th1/ Th2 细胞因子在哮喘小鼠发病中的变化及胸腺素、地塞米松干预作用的研究［J］. 国际呼吸杂志, 2007, 27(7):484-488.

　　［7］ 何皓顿 ，陈吉泉，修清玉.调节性T细胞在哮喘治疗中的新进展［J］. 国际呼吸杂志，2006，26（08）：592-594.