大气污染物对大鼠肺组织CC16及细胞因子mRNA表达的影响
作者:肖纯凌,郭丽,祁荣,席淑华,王任群
【摘要】 目的:测定大气污染物对大鼠肺组织CC16、TNF?α和IL?6的mRNA表达影响,探讨大气污染物对肺损伤的作用机制。方法:用日本产低流量PM10空气采样器采集PM10颗粒物,采样滤膜用生理盐水超声震荡洗脱,混悬液定容为15mg/ml。48只体重为200~240g Wistar大鼠随机分为3个实验组和1个对照组。实验组大鼠分别气管注入1ml 15mg/ml PM10的生理盐水混悬液,对照组大鼠注入1ml生理盐水。次日,实验组大鼠静态吸入浓度分别为15、12、400mg/m3的SO2、NO2、CO空气混合气,每天吸入2h,对照组吸入正常空气。于吸入气体污染物1d、7d和30d后次日分别处死实验组和对照组大鼠,取肺组织,采用RT-PCR方法测定TNF?α、IL?6和CC16的mRNA表达水平。结果:吸入大气污染物组在吸入后1d和7d其肺组织CC16mRNA的表达量明显低于对照组;细胞因子TNF?α和IL?6 mRNA表达增强,高于对照组,并于染毒初期即染毒第1d和第7d增高明显,染毒第30d,又呈下降趋势。结论:大气污染物作用于大鼠呼吸系统后,大鼠肺组织CC16mRNA表达下降,TNF?α和IL?6 mRNA表达增强,并且在污染物作用早期变化明显。
【关键词】 大气污染物;大鼠;Clara细胞分泌蛋白;TNF?α;IL?6,mRNA
AbstractObjective:To study mRNA expression of CC16, TNF?α and IL?6 in pulmonary tissue of rats exposed to air pollutants.Methods:Forty?eight Wistar rats were randomly divided into control group and three pollutants exposure groups. Pollutants exposure rats were intratracheal instillated 1ml PM10 (15 mg/ml) physiological saline suspension and control group rats were intratracheal instillated 1ml physiological saline solution. Next day, three pollutants exposure groups rats were statically inhaled mixed SO2(15 mg/m3), NO2 (12 mg/m3), CO (400 mg/m3) for 2 h per day, and control group rats were given air. The expression inpulmonary tissue of CC16, TNF?α and IL?6 mRNA were examined separately after exposure mixed pollutants 1, 7 and 30 day by RT-PCR.Results:In exposure pollutants groups, CC16 mRNA expression significantly decreased after exposed 1, 7 day, and increased again after 30 days. TNF?α and IL?6 mRNA expression increased in exposure groups after exposed 1, 7 day, and higher than that of control group. At 30 day, TNF?α and IL?6 mRNA expression decreased again. Conclusion:CC16 mRNA expression decrease and TNF?α and IL?6 increase after exposed air pollutants, which change appears early stage of exposure pollutants.
Key wordsair pollutants;rat;CC16;TNF?α;IL?6;mRNA
大气污染物可引起上呼吸道和肺部损伤已有报道。有学者认为炎性介质的过度表达在肺损伤中起关键作用,即损伤肺组织中炎性介质水平与损伤情况直接相关。Clara细胞分泌蛋白(Clara cell secretory 16?kD protein, CC16)是由位于远端终末细支气管的非纤毛上皮细胞所分泌,具有很强的免疫抑制及抗炎活性,参与肺内一系列生理、病理过程,如:炎症、组织重建、肿瘤细胞侵袭与转移等[1]。本研究通过大气污染物的染尘染毒试验,了解大气污染物作用后的大鼠肺组织CC16水平变化和TNF?α和IL?6的mRNA表达情况,探索大气污染物对肺损伤的作用机制,为预防大气污染对机体的损害提供依据。
1 材料与方法
1.1 大气污染物的染毒试验
1.1.1 PM10混悬液制备在冬季采暖季节选择煤烟、和生活污染区进行大气采样,用日本产低流量PM10 空气采样器每天连续24小时,连续采集1个月,将各采样点滤膜用生理盐水超声震荡洗脱,然后将混悬液定容为15mg/ml。
1.1.2SO2、NO2、CO 空气混合气的制备由大连特种气体产业公司提供SO2、NO2、CO标准混合气,其浓度分别为15、12、400 mg/m3。
1.1.3染尘及染毒将48只体重为200~240g Wistar大鼠(雌雄各半)随机分为3个实验组和1个对照组,每组12只。乙醚麻醉下进行气管注入染尘,实验组大鼠分别气管注入1ml 含15mg PM10的生理盐水混悬液,对照组大鼠注入1ml 生理盐水。次日,实验组大鼠静态吸入浓度分别为15、12、400mg/m3的SO2、NO2、CO空气混合气,每天吸入2h,各组分别吸入1d、7d和30d;对照组吸入正常空气。PM10、SO2、NO2、CO浓度均等于国家《环境空气质量标准》(GB3095?1996)二级日标准的100倍。
1.1.4取材于吸入气体污染物1d、7d和30d后次日分别处死实验组和对照组大鼠,经气管插管用37℃生理盐水进行支气管肺泡灌洗,每次2ml,洗3次。BALF离心后,上清液冻存于-80℃备用。取肺组织用于细胞因子和CC16的mRNA表达及免疫组化测定。
1.2CC16、TNF?α和IL?6 mRNA表达检测
1.2.1肺组织总RNA提取取肺组织30mg,用美国基因公司生产的RNA提取试剂盒提取肺组织总RNA。制备的RNA用紫外分光光度计测定光密度,其读数A260/A280>1.8。
1.2.2 RT?PCRCC16采用美国基因公司生产的一步法试剂盒进行mRNA逆转录和扩增。按试剂盒说明逐一加入试剂及1μg总RNA和CC16、GAPDH引物各1μl,体积为50μl。cDNA合成和预变性:50℃30min,94℃1min进行一次循环。PCR扩增:94℃变性45s,56℃退火1min,72℃延伸1min,共30个循环,最后72℃延伸10min。TNF?α和IL?6采用联星生物公司生产的二步法试剂盒进行mRNA逆转录和扩增。按试剂盒说明逐一加入试剂进行逆转录,条件为30℃10min,50℃30min,94℃5min,50℃5min,合成cDNA。PCR扩增:PCR反应体积为50μl,含有TNF?α、IL?6、β-珠蛋白引物各1μl。反应条件为首先94℃5min,然后94℃变性40s,60℃退火40s,72℃延伸90s,反应30个循环,最后72℃延伸7min。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳。用UVP凝胶成像系统扫描分析电泳结果。引物序列见表1。
表1引物序列及PCR产物长度(略)
1.3 统计学处理应用SPSS 10.0统计软件,mRNA半定量测定用组间t检验分析。
2 结果
染毒大鼠肺组织中CC16和细胞因子mRNA的表达(见表2,图1)。
吸入大气污染物组在吸入后1d、7d其肺组织CC16mRNA的表达量明显低于对照组,特别是在染毒1d时下降显著(P<0.01),到染毒30d时,CC16 mRNA表达强度又有回升,与对照组相比差异不显著。TNF?α、IL?6 mRNA表达于染毒第1d和第7d增高明显,与对照比较差异显著(P<0.01或P<0.05);染毒第30d又呈下降趋势。
表2染毒大鼠肺组织CC16, TNF?α及IL?6 mRNA表达水平的比较(略)
注:与对照组比较 1)P<0.05,2)P<0.01
3 讨论
Clara 细胞是排列在支气管粘膜上的一种无纤毛上皮细胞,能够分泌蛋白(CC10或CC16),具有重要的生理功能[2],在肺内具有免疫抑制和抗炎作用。它可抑制炎性介质TNF?α的合成和生物图1大鼠肺组织TNF?α、IL?6、CC16 mRNA表达强度活性,可清除沉积在呼吸道中的有害物质,对肺组织损伤具有保护作用。本研究发现大气污染物作用于大鼠呼吸系统后,大鼠肺组织CC16 mRNA表达量下降,可能是大气污染物损伤肺组织Clara细胞,导致CC16合成减少,这与Hermas的报道[3]相一致。不同染毒时期CC16 mRNA表达量不同,在染毒第1天和第7天下降显著,到染毒第30天时表达量又上调,可能是随染毒时间延长,CC16在体内的大量消耗,Clara细胞的分泌功能代偿性增强,分泌大量CC16,使其在染毒30天后肺组织中mRNA表达有所恢复。
TNF?α、IL?6是主要的促炎介质[4],TNF?α是炎症中重要的启动因子,并能调节IL?1、IL?6等其它细胞因子的释放,导致组织损伤[5]。本研究发现大鼠肺组织促炎细胞因子TNF?α和IL?6 mRNA表达水平在染毒的第1天和第7天明显增高,染毒第30天下降,说明TNF?α、IL?6在急性肺损伤中起重要作用。 CC16与细胞因子相互作用是目前研究热点。一方面,许多细胞因子如TNF?α、IFN-γ等可使CC16 mRNA半衰期延长,于转录后水平调节CC16 mRNA表达。另一方面,CC16使IL?2激活外周血单核细胞合成IFN?γ减少。CC16可能作为内源性细胞因子拮抗因子与细胞因子共同调节炎症反应。有研究报道[6],TNF?α可特异性降低CC16蛋白基因启动子的功能,抑制CC16转录。本研究结果显示大气混合污染物导致肺组织CC16 mRNA表达水平下降,TNF?α、IL?6 mRNA表达水平增加,揭示了CC16与炎性介质之间具有相互作用,对其作用机制还有待进一步研究。
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[1]章晓红, 王曾礼. Clara细胞蛋白与肺部疾病[J]. 国外医学呼吸系统分册, 2002, 22(1): 49-51.
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