TLR4在肝癌细胞株HepG2的表达

【摘要】  　　目的：研究肝癌细胞株HepG2是否有TLR4的表达。方法：采用RT RCR和Western blot检测TLR4 mRNA和蛋白在HepG2细胞的表达情况。结果：HepG2中检测有ＴＬＲ４　ｍＲＮＡ和蛋白的表达。结论：HepG2细胞表面有ＴＬＲ４的表达。 
【关键词】  ＴＬＲ４；肝细胞癌；HepG2
　　Ｔｏｌｌ样受体（ｔｏｌｌ?ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＴＬＲ）是炎症信号传递的门户蛋白，在免疫防御反应中起重要作用。ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ?ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　４，　ＴＬＲ４）是第一个发现的哺乳动物的Ｔｏｌｌ样受体，ＴＬＲ４主要表达在淋巴样组织（如脾）　和外周血白细胞如单核巨噬细胞、树突状细胞、小部分的表皮细胞系以及Ｔ、Ｂ　淋巴细胞系上［１］。研究表明ＴＬＲ４不仅表达在免疫系统相关的细胞中，在一些组织细胞中也有表达，特别是和外界环境相对接触较多的上皮细胞，如胃、肠、肺、牙龈、肾的上皮细胞、肝等［２～４］，研究者还发现许多来源不同组织的肿瘤细胞表面都表达ＴＬＲ４，这可能与肿瘤的免疫微环境的建立与维持有关［５～７］。如胃癌的细胞表面有ＴＬＲ４的表达，而ＴＬＲ４的表达使胃癌细胞可以与幽门螺杆菌相互作用而诱导产生促胃癌细胞生长的因子［８］。研究显示ＴＬＲ４在一些肝脏疾病如病毒型肝炎、肝硬化、肝纤维化、酒精性肝病等的发生及机制中亦有重要作用［９］。本实验利用ＲＴ?ＲＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ方法从基因和蛋白两个角度来检测肝癌细胞株HepG2是否有ＴＬＲ４的表达，这将为今后对ＴＬＲ４的研究奠定基础。
　　１  实验材料与方法
　　１.１  实验材料  HepG2细胞株（医科大学肿瘤研究所第一研究室）；兔抗人ＴＬＲ４一抗（博士德生物技术有限公司）；鼠抗β?ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ公司）；碱性磷酸酶羊抗兔二抗（北京中山生物技术有限公司）；ＰＣＲ引物（大连宝生物公司）；ＤＮＡ分子量标准（大连宝生物公司）；ＲＴ?ＰＣＲ试剂盒（大连宝生物公司）。
　　１.２  实验方法
　　１.２.１  细胞培养  HepG2肝癌细胞株在含１０％胎牛血清的（ＦＢＳ）的ＲＰＭＩ?１６４０培养基中常规培养，　９５％湿度，５％　ＣＯ２，３７℃。每２～３　ｄ换培养基一次，每周传代１次。选生长状态好，处于对数生长期的细胞进行试验。结束培养时，细胞以０.１２５％胰酶消化，４℃离心机离心２次（１　５００ｒ／ｍｉｎ），－７０℃低温冰箱保存待检。
　　１.２.２  Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ  取１ⅹ１０７细胞加入１　ｍｌ细胞裂解缓冲液［１００　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７.５），１００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钠，０.５％脱氧胆酸钠，１　ｍｍｏｌ／Ｌ已二胺四乙酸（ＥＤＴＡ），１％ＮＰ４０，０.１％十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）和蛋白酶抑制剂］，提取细胞的总蛋白并经Ｌａｒｒｙ法定量，取５０μｇ蛋白上样到１５％的ＳＤＳ?聚丙烯酰胺凝胶，电泳（１００　Ｖ，１.５　ｈ）。待溴酚蓝进入凝胶底部后，把蛋白质再印迹到硝酸纤维素膜上，用抗Ｌｉｖｉｎ抗体和抗β?ａｃｔｉｎ抗体孵育，最后加入用碱性磷酸酶（ＡＰ）标记的相应二抗，用ｏ?Ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ，Ｔｅｔｒａｚｏｔｉｚｅｄ和β?Ｎａｐｈｔｈｙｌ　Ａｃｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ显色剂进行显色后用凝胶成像仪分析图像。
　　１.２.３  ＲＴ?ＰＣＲ  采用Ｔｒｉｚｏｌ试剂一步法提取组织总ＲＮＡ，紫外分光光度计测定纯度并定量。根据ＧｅｎＢａｎｋ提供的ＴＬＲ４和内参照β?ａｃｔｉｎ的ｍＲＮＡ序列，应用软件Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ５.０自行设计引物。引物序列如表１。
　　表１  ＴＬＲ４和β?ａｃｔｉｎ引物序列（略）
　　反应条件：９４℃　５　ｍｉｎ，１个循环；９４℃　３０　ｓ，５９℃　３０　ｓ，７２℃　１　ｍｉｎ，３５个循环；７２℃　５　ｍｉｎ后结束扩增反应。取５　μｌ　ＰＣＲ产物与２　μｌ　Ｌｏｄｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ混合，进行１.５％琼脂糖凝胶电泳，１００Ｖ　１.５　ｈ，电泳结束后，凝胶成像仪成像分析。
　　２  实验结果
    
　　ＲＴ?ＰＣＲ的结果  如图１?Ａ所示：在肝癌细胞株ＨｅｐＧ?２中存在ＴＬＲ４基因的转录。如图１?Ｂ所示：在肝癌细胞株ＨｅｐＧ?２中存在ＴＬＲ４蛋白的表达。
    
　　图１  ＴＬＲ４　ｍＲＮＡ和蛋白在ＨｅｐＧ?２中的表达（略）
　　３  讨论
    
　　ＴＬＲ４是新近发现的天然免疫受体，做为Ⅰ型跨膜蛋白，最基本的功能是信号的跨膜转导。最初人们认为ＴＬＲ４主要表达于免疫细胞尤其是巨噬细胞和树突状细胞表面，它们可以通过广泛地特异性地识别病原体相关的分子模式（　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐａｔｔｅｒｎｓ，ＰＡＭＰｓ），偶联信号转导途径，并激活天然免疫细胞，最终导致一系列的免疫炎症反应［１０，１１］。ＴＬＲ４还能识别在应激、损伤和细胞非凋亡性死亡等情况下机体内产生的一些内源性分子，触发免疫细胞和炎症细胞的活化及其释放炎症性细胞因子和趋化因子，参与机体抗感染、抗肿瘤及自身免疫疾病等机制［１２～１３］。以往研究多集中于免疫细胞上的ＴＬＲ４，而针对肿瘤细胞表面ＴＬＲ４的研究很少。目前研究证明，ＴＬＲ４不仅表达在免疫系统相关的细胞中，在多种肿瘤细胞表面也有表达［５～７］，而且肿瘤细胞ＴＬＲ４信号转导途径和免疫细胞基本一致，相反的是肿瘤细胞通过其表面表达的ＴＬＲ４构建了利于肿瘤细胞生存的微环境，逃避机体的免疫攻击［７］。目前在对肝脏疾病的研究过程中发现ＴＬＲ４与一些肝脏疾病如病毒型肝炎、肝硬化、肝纤维化、酒精性肝病等的发生及发展机制中亦有重要作用，病毒性肝炎患者ＤＣ功能的下降可能与ＤＣ中ＴＬＲ表达有很大相关性［９］。在对ＨＣＶ　感染后肝硬化［１４］及ＨＣＶ　疫苗［１４］研究中也发现ＴＬＲ４在病毒性肝炎肝细胞损伤中起着重要作用。同样Ｍｏｚｅｒ?Ｌｉｓｅｗｓｋａ在ＨＣＶ感染的肝细胞监测到了ＴＬＲ４的表达［９］，其可能在慢性病毒性肝炎的病理生理过程中有作用。而病毒感染是肝癌发病的主要原因之一。因此，ＴＬＲ４就有可能在肝癌的发生和发展中发挥一定的作用。
    
　　本实验从基因的角度证明了肝癌细胞株ＨｅｐＧ?２中有ＴＬＲ４基因的转录，从蛋白的角度证实了肝癌细胞株ＨｅｐＧ?２中有ＴＬＲ４蛋白的表达，而且提示ＴＬＲ４表达在肝癌细胞株ＨｅｐＧ?２细胞膜上。表明肝癌细胞株ＨｅｐＧ?２表面有ＴＬＲ４的表达。
    
　　ＨｅｐＧ?２细胞株是目前国际公认的肝癌细胞株，对于肝癌发生、发展、侵袭、转移甚至肝癌的的许多研究都是利用ＨｅｐＧ?２细胞株来完成的，本实验证明了肝癌细胞株表面有ＴＬＲ４的表达，为今后对ＴＬＲ４在肝癌中的作用及其作用途径的研究提供了实验对象，同时也未今后利用ＴＬＲ４进行肿瘤治疗提供了实验对象。
【】
  　　［１］Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ　Ｒ，　Ｐｒｅｓｔｏｎ?Ｈｕｒｌｂｕｒｔ　Ｐ，　Ｊａｎｅｗａｙ　ＣＡ　ＪＲ．Ａ　ｈｕｍａｎ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　Ｔｏｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｉｇｎａｌｓ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄａｐｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，　１９９７，３８８：３９４－３９７．

　　［２］Ｓｏｎｇ　ＰＩ，　Ａｂｒａｈａｍ　ＴＡ，　Ｐａｒｋ　Ｙ，　ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ＬＰＳ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ＣＤ１４　ａｎｄ　Ｔｏｌｌ?ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　４　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ，２００１，４２：　２８６７－２８７７．

　　［３］Ｂａｃｋｈｅｄ　Ｆ，　Ｈｏｒｎｅｆ　Ｍ．　Ｔｏｌｌ?ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　４?ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ　ｂｙ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｓｕｒｆａｃｅｓ：　ｎｅｃｅｓｓｉｔｙ　ｏｒ　ｔｈｒｅａｔ？［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂ　Ｉｎｆｅｃｔ，２００３，５：　９５１－９５９．

　　［４］Ａｂｒｅｕ　ＭＴ，　Ａｒｎｏｌｄ　ＥＴ，　Ｔｈｏｍａｓ　ＬＳ，　ｅｔ　ａｌ．ＴＬＲ４　ａｎｄ　ＭＤ?２　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｓ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｍｍｕｎｅｍｅｄｉａｔｅｄ　ｓｉｇｎａｌｓ　［Ｊ］．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００２，２７７：　２０４３１－２０４３７．

　　［５］Ｍｏｎｉｃａ　Ｍｏｌｔｅｎｉ，　Ｄｅｂｏｒａｈ　Ｍａｒａｂｅｌｌａ，　Ｃｈｉａｒａ　Ｏｒｌａｎｄｉ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｅｌａｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ａｒｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｏ　ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ＴＬＲ?４［Ｊ］．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００６，２３５（１）：　７５－８３．

　　［６］Ｈｕａｎｇ　Ｂ，　Ｚｈａｏ　Ｊ，　Ｌｉ　Ｈ，　ｅｔ　ａｌ．Ｔｏｌｌ?ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｏｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ　ｅｖａｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ［Ｊ］．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００５，６５（１２）：５００９－５０１４．

　　［７］Ｒｕｔｈ　Ｍ　Ｒ，Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ　Ｇ，Ｃｌｉｆｆｏｒｄ　ＣＴ，　ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｒｅｑｕｉｒｅ　Ｔｏｌｌ?ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　４　ｆｏｒ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　１３?ｄｅｆｅｎｓｉｎ　２　ｂｙ　Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ［Ｊ］．　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，６：　１１６．

　　［８］Ｈａｒｍｅｙ　ＪＨ，　Ｂｕｃａｎａ　ＣＤ，　Ｌｕ　Ｗ，　ｅｔ　ａｌ．Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ?ｉｎｄｕｃｅｄ　ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ　ｉｎｖａｓｉｏｎ［Ｊ］．　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２００２，１０１：４１５－４２２．

　　［９］金生，张大志，陈压西．　Ｔｏｌｌ样受体与肝脏疾病［Ｊ］．中华内科杂志，２００５，４４（１）：　６８－６９．

　　［１０］Ｓｃｈｍａｕｓｓｅｒ　Ｂ，　Ａｎｄｒｕｌｉｓ　Ｍ，　Ｅｎｄｒｉｃｈ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｏｌｌ?ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ＴＬＲ４，　ＴＬＲ５　ａｎｄ　ＴＬＲ９　ｏｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ：　ａｎ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｍｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，２９５（３）：　１７９－１８５．

　　［１１］Ａｋｉｒａ　Ｓ，　Ｔａｋｅｄａ　Ｋ．　Ｔｏｌｌ?ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ［Ｊ］．　Ｎａｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２００４；　４：　４９９－５１１．

　　［１２］Ｏｋａｍｏｔｏ　Ｍ，　Ｏｓｈｉｋａｗａ　Ｔ，　Ｔａｎｏ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｏｌｌ?ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　４　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ?γ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ｅｆｆｅｃｔ　ｂｙ　ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ａｇｅｎｔ　ＯＫ?４３２［Ｊ］．　Ｊ　Ｎａｔｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ），２００３，９５：　３１６－３２６．

　　［１３］Ｏｋａｍｏｔｏ　Ｍ，　Ｆｕｒｕｉｃｈｉ　Ｓ，　Ｎｉｓｈｉｏｋａ　Ｙ，　ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｏｌｌ?Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　４　ｏｎ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｉｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｆｏｒ　ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ?ｂａｓｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａｎ　ａｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｏｆ　ＯＫ?４３２，　ａ　ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００４，６４（８）：　５４６１－５４７０．

　　［１４］Ｋａｉｓｈｏ　Ｔ，　Ａｋｉｒａ　Ｓ．　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｔｏｌｌ?ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ［Ｊ］．　Ｃｕｒｒ　Ｍｏｌ　Ｍｅｄ，２００３，３：　３７３－３８５．

　　［１５］Ｄｕｅｓｂｅｒｇ　Ｕ，　Ｖｏｒｒ?ｄｅｍ?Ｂｕｓｓｃｈｅ　Ａ，　Ｋｉｒｓｃｈｉｎｇ　Ｃ，　ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ　（ＨＣＶ）?ｃｏｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｏｌｌ　ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　（　ＴＬＲｓ）　２　ａｎｄ　４［Ｊ］．　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｌｅｔｔ，２００２，８４：　８９－９５．