基于脂肪干细胞I型胶原凝胶PLGA?β?TCP支架的新型仿生骨组织工程复合体的构建及生物学性能

           作者：郝伟，胡蕴玉，姜明，吕荣，王军，赵廷宝  

【摘要】  目的：尝试构建基于脂肪干细胞、I型胶原凝胶以及PLGA?β?TCP支架的新型仿生骨组织工程复合体，并对其生物学性能进行研究. 方法：取3 mo龄日本大耳白兔皮下脂肪，获得脂肪干细胞，经体外成骨诱导分化鉴定后使用I型胶原凝胶将其悬浮并与三维多孔支架PLGA?β?TCP复合，从而构建成脂肪干细胞?I型胶原凝胶/PLGA?β?TCP骨组织工程复合体，体外成骨诱导培养2 wk，实验以脂肪干细胞/PLGA?β?TCP材料复合体作为对照. 扫描电镜观察复合情况，并对脂肪干细胞的增殖以及成骨诱导分化情况进行检测. 结果：I型胶原凝胶将rADSCs均匀悬浮于材料孔隙中，碱性磷酸酶活性以及细胞外基质矿化程度检测显示I型胶原凝胶能显著促进rADSCs的成骨分化. 结论：脂肪干细胞?I型胶原凝胶/PLGA?β?TCP复合体的构建成功为骨组织工程复合体的设计提供了一条新的思路.

【关键词】  脂肪干细胞； I型胶原凝胶； PLGA?β?TCP支架； 骨组织工程

　　【Abstract】 AIM: To fabricate a novel bone tissue engineering construct using collagen I gel to suspend adipose?derived stem cells (ADSCs) into a porous PLGA?β?TCP scaffold (rADSCs?COL/PLGA?β?TCP) and explore its potentiality for bone tissue engineering. METHODS: ADSCs were prepared by collagenase I digestion of subcutaneous fat from the suprascapular site of Japanese white rabbit. Firstly, the osteogenic differentiation of rabbit ADSCs (rADSCs) was identified by von Kossa staining after in vitro culture for 4 weeks under osteogenic medium. Then the rADSCs?COL/PLGA?β?TCP composite was fabricated using collagen I gel to suspend rADSCs into PLGA?β?TCP scaffold and cultured under osteogenic medium for 2 weeks. Meanwhile, the single combination of rADSCs and PLGA?β?TCP scaffold was also prepared as control. Morphological observations were carried out using scanning electron microscopy (SEM). Cell proliferation, alkaline phosphatase activity and calcium deposit were also determined to fully evaluate the osteogenic differentiation of rADSCs in both composites. RESULTS: By presuspended in collagen I gel, the rADSCs were evenly distributed in the pores of the PLGA?β?TCP scaffold. Furthermore, collagen I gel remarkably promoted the osteogenic differentiation of rADSCs in PLGA?β?TCP scaffold. CONCLUSION: The successful fabrication of rADSCs?COL/PLGA?β?TCP composite casts a new light on the construction of bone tissue engineering composites.

　　【Keywords】 adipose?derived stem cells; collagen I gel; PLGA?β?TCP; bone tissue engineering

　　0  引言
   
　　生物支架材料是骨组织工程研究中的一个重要环节［1］. 目前常用的生物材料例如高分子聚合物、生物陶瓷等，在与种子细胞复合过程中仅仅能够起到机械性支架作用，而缺乏生物活性，在与种子细胞复合以后，难以与其形成良好互动，对其进一步的增殖、成骨分化施加积极影响. 而I型胶原作为骨组织中主要的有机成分，在骨形成过程以及维持正常骨结构中发挥了重要作用［2］. 为此，我们从仿生学角度考虑，初步尝试利用I型胶原凝胶悬浮脂肪干细胞（adipose?derived stem cells, ADSCs）与三维多孔支架PLGA?β?TCP复合构建一种新型仿生骨组织工程复合体，并对其生物学性能进行研究，以探讨将其应用于骨缺损修复的可行性.

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  3 mo龄成年日本大耳白兔，由第四军医大学实验动物中心提供；DMEM培养基、地塞米松、抗坏血酸、β?甘油磷酸钠、Ⅰ型胶原酶、磷酸对硝基苯酚（PNPP）、对硝基苯酚（PNP）均购自SIGMA公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；碱性磷酸酶检测试剂盒购自上海仁宝试剂公司；细胞外钙定量检测试剂盒（Calcium C kit, WAKO Pure Chemical Industries）.

　　1.2  方法

　　1.2.1  兔ADSCs（rabbit ADSCs, rADSCs）的原代培养  3 mo龄成年日本大耳白兔，耳缘静脉注射空气处死. 常规备皮，消毒，取其颈背部皮下脂肪. 分离肉眼可见的筋膜、血管，无菌PBS冲洗3遍，眼科剪将组织剪成1～2 mm3组织块，置于1.5 g/L Ⅰ型胶原酶中于37℃消化1 h. 100目筛网过滤后900 r/min离心10 min，用普通培养液（含100 mL/L胎牛血清的DMEM）重新悬浮、接种. 待细胞达90％汇合时用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代.

　　1.2.2  rADSCs的成骨诱导分化鉴定  采用第3代rADSCs，以105个/孔接种于6孔板，待其完全贴壁后于普通培养液中加入10-7 mol/L地塞米松、抗坏血酸50 mg/L和10 mmol/L β?甘油磷酸钠进行成骨诱导，4 wk后采用冯库萨（von Kossa）钙染色法检测诱导分化情况.

　　1.2.3  PLGA?β?TCP支架的制备  由清华大学激光快速成型中心将聚乳酸?聚乙醇酸（PLGA）［poly?lactide (50%)?co?glycolide (50%)］与β?磷酸三钙（β?TCP）按照7∶3，W/W的比例经快速成型技术低温沉积工艺制成［3］，具有良好的孔隙率（>90 %）以及孔径（300 ～350 μm）.

　　1.2.4  I型胶原凝胶溶液的制备  将I型胶原用100 mL/L，V/V醋酸溶解并定容至50 mg/L，然后将其以10∶1∶1的比例与10×的DMEM及胎牛血清混合，最后使用1 mol/L NaOH调整溶液pH至7.4. Co60消毒灭菌，置于4℃备用.

　　1.2.5  rADSCs?I型胶原凝胶/PLGA?β?TCP骨组织工程复合体的构建（rADSCs?COL/PLGA?β?TCP）  使用第3代rADSCs，待其达100％汇合后2.5 g/L胰蛋白酶消化、离心，于冰浴条件下使用100 μL I型胶原凝胶溶液以2×109个/L的密度悬浮细胞并均匀滴加于PLGA?β?TCP支架材料孔隙中，37℃作用0.5 h以使胶原凝胶溶液凝结. 最后加入成骨诱导培养液于37℃ 50 mL/L CO2条件下进行成骨诱导培养. 同时设立无细胞I型胶原凝胶/PLGA?β?TCP复合体作为对照（COL/PLGA?β?TCP）.

　　1.2.6  rADSCs/PLGA?β?TCP骨组织工程复合体的构建（rADSCs/PLGA?β?TCP）  使用第3代rADSCs，待其达100％汇合后2.5 g/L胰蛋白酶消化、离心，以2×109个/ L的密度悬浮细胞. 取100 μL细胞悬液均匀接种于预处理的PLGA?β?TCP支架中. 于37℃ 50 mL/L CO2条件下共培养4 h，使细胞与材料充分复合. 最后加入成骨诱导培养液进行培养. 同时设立空白PLGA?β?TCP支架材料作为对照.

　　1.2.7  材料中细胞增殖检测  于接种后4 h和第1，3，7，10，14 d进行细胞增殖测定. rADSCs?COL/PLGA?β?TCP复合体组：将培养液吸除后加入20 g/L的I型胶原酶于37℃条件下作用45 min以彻底分解I型胶原纤维，等量培养液中和后将细胞悬液吸出并于1200 r/min离心10 min. rADSCs/PLGA?β?TCP复合体组：将培养液吸出后加入2.5 g/L胰蛋白酶消化5 min，等量培养液中和，900 r/min离心9 min. 最后将细胞团块重新悬浮于培养液中进行细胞计数并初始细胞接种密度（复合细胞数量/总细胞数量）（每组每个时间点共有4例标本）.

　　1.2.8  碱性磷酸酶活性检测  采用PNPP法. 步骤：于诱导培养第7和14日，收集rADSCs?COL/PLGA?β?TCP和rADSCs/PLGA?β?TCP复合体细胞（实验方法同1.2.7）. 将两组细胞经超声裂解后，加入PNPP于37℃反应30 min，0.1 mol/L NaOH中止反应. 于405 nm处读取A值. 参照总蛋白定量以及预先绘制的PNP标准曲线，将碱性磷酸酶活性单位定义为每分钟每微克总蛋白中所含PNP纳摩尔数（nmol PNP/μg protein/min）（每组每个时间点共有4例标本）.

　　1.2.9  细胞外基质矿化程度检测  采用OCPC法. 于诱导培养第7和14日，收集rADSCs?COL/PLGA?β?TCP以及rADSCs/PLGA?β?TCP复合体细胞（方法同1.2.7），加入0.5 mol/L HCl于常温下过夜，将细胞外不溶性钙盐分解成可溶性钙离子，实验操作按照Calcium C Kit说明书进行. 钙离子浓度以μg/105个细胞表示（每组每个时间点共有4例标本）.

　　1.2.10  形态学观察  在诱导培养2 wk后，将各组复合体取出，进行扫描电镜观察. 实验步骤：无菌PBS冲洗3遍，2.5 g/L戊二醛固定，逐级梯度酒精脱水，临界点干燥. 经表面喷金后置于镜下观察.
   
　　统计学处理：  所有计数资料均采用x±s表示，采用SPSS 11.0 软件进行配对t检验， P<0.05为差异具有统计学意义.

　　2  结果

　　2.1  rADSCs的体外培养及成骨诱导分化鉴定  于体外培养条件下，原代培养rADSCs呈成纤维细胞样，传代后细胞形态变化不大，仍呈梭形、三角形，增殖能力旺盛. 连续培养至第15代仍保持良好的细胞形态与增殖能力（图1A）. 换用成骨诱导液干预4 wk后经von Kossa染色可见细胞及其周围附着的钙盐与硝酸银发生置换反应而被染成黑色，说明此时细胞外基质矿化，成骨分化基本完成（图1B）.

　　A：原代培养rADSCs  相差 ×100；     B：von Kossa染色  相差 ×200.

　　图1  体外培养兔ADSCs细胞（略）

　　2.2  材料中的细胞增殖情况  rADSCs?COL/PLGA?β?TCP复合体组的初始细胞接种密度为(97.20±2.30)%，而rADSCs/PLGA?β?TCP复合体组仅为(36.50±3.80)%，前者显著高于后者（n=4，P<0.05）. 经体外诱导培养14 d 后，rADSCs?COL/PLGA?β?TCP复合体组为(3.55±0.20)×105个细胞（n=4），而rADSCs/PLGA?β?TCP复合体组为(2.34±0.18)×105个细胞（n=4），差异具有统计学意义（P< 0.05）.

　　2.3  碱性磷酸酶活性定量检测  诱导培养1 wk后，rADSCs?COL/PLGA?β?TCP复合体组碱性磷酸酶活性为(0.27±0.02) nmol PNP/μg protein/min， 而rADSCs/PLGA?β?TCP复合体组为(0.14±0.02) nmol PNP/μg protein/min，前者显著高于后者；诱导培养2 wk后rADSCs?COL/PLGA?β?TCP复合体组碱性磷酸酶活性则高达(0.85±0.27) nmol PNP/μg protein/min，显著高于rADSCs/PLGA?β?TCP复合体组(0.51±0.14) nmol PNP/μg protein/min，两组差异具有统计学意义（n= 4,  P<0.05）.

　　2.4  细胞外基质矿化程度检测  诱导培养1 wk后，rADSCs?COL/PLGA?β?TCP复合体组细胞外基质矿化程度［(23.69±3.50) μg/105个细胞］与rADSCs/PLGA?β?TCP复合体组［(20.90±1.68) μg/105个细胞］差异无统计学意义（n= 4,  P>0.05）；而2 wk后前者［(71.88±2.89) μg/105个细胞］则显著高于后者［(48.10±2.77) μg/105个细胞］（n=4,  P<0.05）.

　　2.5  形态学观察  扫描电镜显示，PLGA?β?TCP支架材料为规则的相互的多孔状三维立体结构（图2A），而对于无细胞COL/PLGA?β?TCP复合体组，可以看到I型胶原纤维均匀分布于材料表面及孔隙中（图2B）. 在rADSCs/PLGA?β?TCP复合体组中，rADSCs仅贴附于材料表面，孔隙中没有细胞长入(图2C). 然而在rADSCs?COL/PLGA?β?TCP复合体组中，材料孔隙被悬浮于胶原凝胶中的rADSCs所完全充填(图2D). 复合细胞共培养2 wk后，rADSCs?COL/PLGA?β?TCP和rADSCs/PLGA?β?TCP复合体组中的rADSCs在材料孔隙中均呈成纤维细胞样生长(图2E，F).

　　A: PLGA?β?TCP支架材料（▲：材料的小梁， △：材料的孔隙） ×60；B: COL/PLGA?β?TCP复合体  ×70；C: rADSCs/PLGA?β?TCP复合体  ×50；D: rADSCs?COL/PLGA?β?TCP复合体  ×50；E: 为C图白框的放大，rADSCs贴附于材料表面呈复层生长（←: rADSCs）  ×300；F: 为D图白框的放大，rADSCs填满材料的孔隙（▲: I型胶原凝胶经扫描电镜样品处理程序处理后所形成的胶原颗粒， △: rADSCs） ×200.

　　图2  扫描电镜观察（略）

　　3  讨论
   
　　在骨组织工程复合体的构建过程中，三维多孔支架材料所具有的孔隙率以及孔径大小具有重要意义. Karageorgiou等［4］报道的当支架材料具有良好的孔隙率以及孔径大于300 μm时，在体内能够明显促进新生骨组织形成以及新生血管长入，从而能够在骨缺损修复过程中发挥重要作用. 然而，良好的孔隙率以及孔径往往会导致种子细胞在与材料复合时的大量丢失. 本研究采用具有良好的骨缺损修复能力的PLGA?β?TCP 作为支架材料［3，5］. 实验结果显示直接将rADSCs滴加于PLGA?β?TCP材料时，仅有一少部分细胞成功与材料复合，大部分细胞由于材料的孔隙率而丢失. 因此，具有良好的孔隙率以及孔径的支架材料虽然具有良好的骨传导性，但是由于其表面积相对有限，采用传统直接滴加细胞的接种方式并不能够促成细胞在材料孔隙中的均匀分布.
   
　　为了解决这个问题，在本实验中I型胶原凝胶被用来实现脂肪干细胞与材料的均质复合. I型胶原凝胶作为水凝胶类支架的一种，其所具有的半固体、半液态的特点使其不仅能够相对容易的实现细胞的均匀分布，而且能够通过物理性捕获效应将大量细胞限制于其中，一方面解决了细胞与材料的复合问题，另一方面也解决了在接种过程中细胞的丢失问题. 此外，作为正常骨组织结构中主要的有机成分， I型胶原能够调控细胞黏附［6］，促进成骨细胞的增殖［7］、分化并能够引导骨组织再生［8］. 因此，在本实验中我们使用PLGA?β?TCP多孔支架、rADSCs以及I型胶原凝胶来构建了一种新型仿生骨组织工程复合体. 实验结果显示I型胶原凝胶能够显著促进复合体中rADSCs的碱性磷酸酶活性以及细胞外基质矿化程度（rADSCs?COL/PLGA?β?TCP复合体组＞rADSCs/PLGA?β?TCP复合体组，P<0.05）.
   
　　综上所述，我们通过将rADSCs悬浮于I胶原凝胶后再与PLGA?β?TCP支架复合构建了一种新型仿生骨组织工程复合体（rADSCs?COL/PLGA?β?TCP），与传统直接滴加细胞接种方式所构建的复合体相比（rADSCs/PLGA?β?TCP），本研究采用的构建方法材料孔隙中的rADSCs分布均匀且密度高，进一步体外成骨诱导分化相关检测显示I胶原凝胶能够显著促进rADSCs在材料中的成骨分化，为骨组织工程复合体的构建提供了新的思路.

【】
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