大鼠三叉神经中脑核神经元放电滞后现象的动力学分析

             作者：秦杨，刘一辉，杨晶，王文挺，邢俊玲，胡三觉

【摘要】  目的：利用非线性动力学理论的分析手段阐明三叉神经中脑核神经元放电滞后现象的产生机制. 方法：应用脑片全细胞膜片钳技术记录大鼠三叉神经中脑核（Mes V）神经元在三角波电流刺激下的放电特征，运用动力学方法对其进行分析. 结果：Ⅱ型MesV神经元放电表现出滞后现象，加入4?AP转型后滞后现象消失；非线性动力学分岔理论可以对以上现象做出解释. 结论：Ⅱ型神经元的亚临界霍普夫分岔使得其存在滞后现象.

【关键词】  三叉神经中脑核；神经元；电生；分岔；转型；I4?AP

　　【Abstract】 AIM: To elucidate the discharge hysteresis pheno?menon in mesencephalic V (Mes V) neurons using nonlinear dynamics theory. METHODS: Whole?cell patch clamp technique was used for firing recording and nonlinear dynamic theory was used to analyze the producing mechanism of discharge hyste?resis phenomenon in Mes V neurons. RESULTS: Hysteresis of discharge was observed in type 2 Mes V neurons. After application of 4?AP, type 2 firing pattern was transferred to type 1, in which hysteresis disappeared. The nonlinear dynamic bifurcation theory could provide explanation for this phenomenon. CONCLUSION: It is the character of subcritical Andronov?Hopf bifurcation that leads to the discharge hysteresis in type 2 Mes V neurons.

　　【Keywords】 Mes V; neurons; electrophysiology; bifurcation; transition; I4?AP

　　0  引言
   
　　Hodgkin等根据单个神经元动作电位发放模式可把膜兴奋性分为两种“类型”［1］：Ⅰ型兴奋性神经元放电阈值较低，并且随着刺激强度的增大，放电频率逐渐增大；Ⅱ型神经元的放电频率相对集中在一个较小的范围内，并不随着刺激强度的变化而有显著的变化. 三叉神经中脑核（Mesencephalic V,Mes V）神经元是位于中枢的初级感觉传入神经元，是传递和调控口面部本体感觉信息的重要部位［2］. 我们在对三叉神经中脑核的研究中观察到了两种类型放电模式的存在. 同时发现在三角波电流刺激下，Ⅱ型兴奋性神经元的放电模式存在一种物理学上所谓的滞后现象，表现为序列放电中,起始动作电位的阈强度大于结束时动作电位的阈强度［3］. 传统的生物学理论对以上现象难以做出满意的解释.
   
　　非线性动力学分析具有定量准确的特点，已广泛用于神经元放电，包括对MesV神经元放电的研究［4-7］，我们希望以此对所记录到的现象进行合理的分析. 分岔在非线性动力学理论中是指系统行为的定性变化［8］. 对于神经元来说，处于静息电位时是一种状态，当细胞持续放电，即膜电位大幅周期性振荡是另一种状态，细胞从静息状态向放电状态的转变，也就是膜电位从保持不变向周期振荡的转变，就是一种神经元性质的定性变化，反之亦然. 因此，可以将细胞所经历的这种转变称为细胞所经历的分岔. 本研究运用分岔理论对MesV神经元滞现象进行分析讨论，以突破传统电生理理论的局限.

　　1  材料和方法

　　1．1  材料  两周龄新生SD大鼠，体质量22～30 g，雌雄不限（第四军医大学实验动物中心）；1.4 mm内径记录电极玻璃毛坯（南京泉水教学实验器材厂）；戊巴比妥钠，NaCl，KCl，CaCl2，MgCl2，NaH2PO4，NaHCO3，K?glucose和Glucose（天津市医药公司）；乳酸（lactic acid）,四乙酸(EGTA)，羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，K2?ATP, Na?GTPh和4?氨基吡啶（4?AP）（美国Sigma公司）； 渗透压仪（Model 501, 美国Precision system公司）；振动切片机(1000 plus, 美国Vibratome公司)；正置微分干涉相差显微镜(BX51WI, 日本Olympus公司)； 膜片钳放大器（Multiclamp 700A）,模拟?数字转换器(Digidata 1322A，美国Axon公司)；微电极拉制仪(PP?83型， 日本Narishige Instruments公司)；恒流泵(HL?2型，上海沪西仪器厂).
   
　　细胞外液（人工脑脊液，artificial cerebrospinal fluid, ACSF）配方为（mmol/L）：124 NaCl, 26 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glucose；切片用液（Cuting solution）配方为（mmol/L）：126 NaCl, 26 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 CaCl2, 5 MgCl2,  10 glucose，以上两种液体用1 mol/L HCl将pH值调为7.3左右，渗透压为290～310 mOsm/L；记录内液配方（mmol/L）：9 NaCl, 115 K?glucose，1 MgCl2，10 HEPES，0.2 EGTA，3K2?ATP，Na?ATP用NaOH将pH值调为7.2左右，渗透压为298 mOsm/L，离心管分装冻存备用；4?氨基吡啶（4?AP）用ACSF配成0.5 mmol/L分装离心管冻存，用时用ACSF稀释10倍.

　　1．2  方法

　　1．2．1  大鼠脑片制作  用戊巴比妥钠（40 mg/kg,ip）麻醉后，将大鼠迅速断头，剪开头皮，咬骨钳咬开颅骨，取出全脑置于含950 mL/L O2和50 mL/L CO2饱和的冰冷的切片用液. 2 min后取出放在浸有ACSF的滤纸上将全脑修块，然后用502胶水粘在切片槽的固定位置. 槽中放有冰冷的ACSF（小于4℃），并不断通入含950 mL/L O2和50 mL/L CO2混合气体. 用振动切片机切出含MesV在内的300 mm的冠状脑片，切好的脑片置于25℃下含950 mL/L O2和50 mL/L CO2饱和气体的ACSF中孵育30 min［7］.

　　1．2．2  脑片固定与灌流  将脑片移至记录用灌流槽内，浸没于液面下l～2 mm，用铂金丝制成U形框架，将尼龙丝粘于其上，制成盖网轻覆于脑片上. 使用恒流泵持续向脑片浴槽灌注含950 mL/L O2和50 mL/L CO2饱和气体的ACSF，流速为2～3 mL/min，灌流槽温度保持在26～30℃.

　　1．2．3  全细胞膜片钳记录  玻璃微管洗净烘干后由微电极拉制仪拉制成尖端直径约为1～2 μm，充灌电极内液后的入水阻抗为3～5 MΩ的玻璃电极. 实验在正置红外微分干涉显微镜下进行，用5×物镜观察定位Mes V，40×水镜确认细胞，选取大于35 mm者进行可视巨阻封接. 成功后采用口吸破膜形成全细胞模式.电容和液接电位（约5 mV）线下补偿，记录膜被动参数，选取静息电位大于-55 mV,动作电位幅值大于70 mV进行实验.刺激所用三角波电流用Clampex 9.2编写，刺激强度为600 pA，持续时间600 ms.
   
　　统计学处理:  实验中所有电刺激均从胞内给予，模拟?数字转换器采样频率10 kHz，低通滤波频率为3 kHz；数据采集、记录采用Axon laboratory提供的软件包Clampex 9.2进行，分析软件采用Clampfit 9.2，绘图和统计软件采用Origin 6.1. 所有数据用x±s表示，用SPSS 11.0进行配对t检验.

　　2  结果
   
　　随机选取34例Mes V神经元统计基本电生理参数：静息膜电位Vm=（60.3±2.5） mV，膜电阻Rm=（82.7±26.5） MΩ,膜电容Cm=（68.0±12.9） pF.

　　2.1  两时象斜波刺激下MesV神经元放电的滞后现象  选取Ⅱ型放电模式神经元，在三角波电流刺激下此类神经元表现出明显的滞后现象，即起始动作电位阈强度I1大于结束动作电位的阈强度I2，结束的动作电位的时刻较起始动作电位的时刻滞后（图1）. 根据统计学分析此类神经元I1和I2，阈电位V1和V2的差异有统计学意义(P<0.01, 表1). 4?AP能够抑制Mes V神经元上低电位激活的钾电流(I4?AP)从而改变细胞的放电类型，灌流加入4?AP(50 μmol/L)神经元的放电类型从Ⅱ型转型为Ⅰ型，同样的刺激方式在已转为Ⅰ型放电模式的神经元上没有出现滞后现象（图2）. 根据统计学分析此类神经元I1和I2，V1和V2的差异无统计学意义（P>0.05, 表1）.

　　图1  缓慢三角波电流刺激使Ⅱ型兴奋性神经元放电出现滞后现象（略）

　　表1  Ⅰ型和Ⅱ型放电神经元起始与结束放电阈强度及阈电位水平的比较（略）

　　bP<0.01 vs起始放电.

　　2.2  两种类型放电神经元动力学分岔图  利用已有的三叉神经中脑核神经元放电的模型资料［2］，可得Ⅱ型（图3A）和Ⅰ型（图3B）放电神经元放电的动力学分岔图.

　　图2  4?AP作用下神经元转变为一类放电模式，滞后现象消失（略）

　　A: 为Ⅱ型神经元的亚临界霍普夫分岔图，方框内为双稳态区; B: 为Ⅰ型神经元的鞍?结不变环分岔图. HB为分岔点，实线表示稳定的不动点，虚线表示不稳定的不动点，实心圆圈表示稳定周期解的最大值与最小值，虚心圆圈表示不稳定周期解的最大值与最小值.

　　图3  两类放电神经元动力学分岔图（略）

　　3  讨论
   
　　传统电生理理论把神经元兴奋性定义为产生动作电位的能力，并从阈值、幅度、频率、时程、动作电位的具体形态等来对神经元的放电进行描述和分类. 本文中的分类方式即是采用频率对刺激强度的反应作为标准. 然而此种理论和方法仅能对丰富的放电现象进行定性的描述. 例如传统理论认为可兴奋细胞存在一阈值，当刺激强度达到阈值时爆发动作电位，低于阈值不会爆发动作电位. 本实验中观察到的两种类型兴奋性神经元对相同类型刺激产生不同的放电模式，其中Ⅱ型兴奋性神经元所产生的滞后现象用传统的定性的电生理理论关于阈值的定义则无法做出解释.
   
　　Guttman等［3］利用HH方程研究枪乌贼巨轴突重复放电时，从解得的极限环图中曾预测轴突的放电存在滞后现象（hysteresis）,并在实验中得到证实.本实验在Mes V神经元上也观察了此种现象，并且观察到加入4?AP使神经元兴奋类型转变后滞后现象消失.
   
　　非线性动力学理论认为：产生不同兴奋性类型的原因是系统经历了不同类型的分岔［9］. 当系统经历鞍?结不变环分岔时，产生Ⅰ型兴奋性；而当系统经历霍普夫分岔或鞍?结分岔时，产生Ⅱ型兴奋性. 我们对MesV神经元的研究发现MesV神经元的放电属于亚临界霍普夫分岔，并且在施加药物4AP后这种亚临界霍普夫分岔的性质会被掩盖而转型为鞍?结不变环分岔［2］. 利用分岔理论对滞后现象的产生和消失进行解释十分直观.
   
　　从分岔图上（图3A）可以很清楚的看出，Ⅱ型兴奋性神经元在放电的起始区有一个很明显的双稳态区，在刺激电流由小到大和由大到小连续缓慢变化的过程中，在两个稳态之间跳跃的临界点不同，也就是所达到的刺激电流的大小不同. 当刺激电流由小到大时，膜电位只有到达HB点时产生跳跃（分岔），而当刺激电流由大到小时膜电位因仍处于稳态区会越过HB在跳跃（分岔）. 表现出动作电位起始的阈强度大于其结束时的阈强度，于是产生了滞后现象. 也可以说滞后现象就是亚临界霍普夫分岔的重要性质. 在Ⅱ型兴奋性神经元上加入钾电流阻断剂4?AP后，由于I4?AP的减小它的动力学过程由Ⅱ型转变为Ⅰ型. 其动力学分岔图也发生了改变（图3B）. 从Ⅰ型兴奋性神经元的动力学分叉图上可以看出，不存在一个双稳态区，膜电位会随着刺激电流的增大见效在HB点处跳跃（分岔），不能产生滞后现象. 借助数学模型，通过动力学分析，传统理论无法解释的神经元放电现象得以了合理的说明.

【】
  　　［1］ Hodgkin AL. The local electric changes associated with repetitive action in a non?medullated axon［J］. J Physiol, 1948,107:165-181.

　　［2］ Liu Y, Yang J, Hu S. Transition between two excitabilities in mesencephalic V neurons［J］. J Comput Neurosci, 2007：http://www.springerlink.com/content/g7378651363q3776/fulltext.pdf

　　［3］ Guttman R, Lewis S, Rinzel J. Control of repetitive firing in squid axon membrane as a model for a neuroneoscillator［J］. J Physiol, 1980,305:377-395.

　　［4］ Del Negro CA, Chandler SH. Physiological and theoretical analysis of K+ currents controlling discharge in neonatal rat mesencephalic trigeminal neurons［J］. J Neurophysiol, 1997,77:537-553.

　　［5］ Tanaka S, Wu N, Hsaio CF, et al. Development of inward rectification and control of membrane excitability in mesencephalic v neurons［J］. J Neurophysiol, 2003,89:1288-1298.

　　［6］ Wu N, Enomoto A, Tanaka S, et al. Persistent sodium currents in mesencephalic v neurons participate in burst generation and control of membrane excitability［J］. J Neurophysiol, 2005,93: 2710-2722.

　　［7］ Wu N, Hsiao CF, Chandler SH. Membrane resonance and subthreshold membrane oscillations in mesencephalic V neurons: Participants in burst generation［J］. J Neurosci, 2001,21:3729-3739.

　　［8］ Alligood K, Sauer T, Yorke J, et al. An introduction to dynamical systems［M］.New York:Springer?Verlag,1996: 17-21.

　　［9］ Koch C, Segev I. Methods in neuronal modeling: From ions to networks［M］. London: The MIT Press Cambridge,1998：251-291.