神经营养素3对大鼠急性脊髓损伤后血中一氧化氮合成酶的影响

           作者：郭树章 任先军 蒋涛 欧阳忠

【关键词】  脊髓损伤;

    摘要：［目的］探讨NT3(神经营养素3)对脊髓损伤保护作用的机制。［方法］105只SD大鼠随机分为3组：对照组(生理盐水组)，实验组(NT3组)和假手术组，每组35只，各分为7个时相点，每个时相点5只大鼠。采用Allen’s法以30gcm力致伤大鼠T8脊髓，经蛛网膜下腔导管分别于术后0、4、8、12、24h、3、7d各注入NT3溶液200ng与生理盐水组和假手术组对照，于术后4、8、12、24h、3、7、14d自右心室取血用比色法测定血清中的一氧化氮合成酶活性。［结果］大鼠脊髓损伤后一氧化氮合成酶(NOS)升高，术后12h达高峰，实验组NOS水平及升幅明显低于对照组。［结论］NT3能有效抑制NOS在脊髓损伤后的活性，从而减少了NO的生成，这可能是促进大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的作用机制之一。

　　关键词：神经营养因子3；脊髓损伤;一氧化氮合成酶

　　Effect of neurotrophin3 on blood NOS after actual spinal cord injury of rats

　　Abstract：［Objective］To investigate the protective mechanism of neurotrophin3(NT3) in spinal cord injury(SCI).［Method］One hundred and five SD rats were  randomly  divided  into 3 groups:control  group(saline group),experimental group(NT3 group) and sham group. SCI in SD rats was created with Allen's method by a 30gcm impacting on the posterior T8 spinal cord. NT3 was grafted into the subarachnoid space of the rats in treatment group immediately and 4,8,12, 24h and 3,7d after spinal cord injury. The nitricoxidesynthase (NOS) activity in rats blood were assayed with colorimetric methods in 4,8,12,24h and 3,7,14d.［Result］Abnormal activity expression of NOS was detected in serum of injured rats, and reached peak at 12 hours after the injury.The level of NOS activity in NT3 group was significantly lower as compared with that in control saline group.［Conclusion］NT3 can protect spinal cord from injury in vivo,and inhibit abnormal expression of nitricoxidesynthase(NOS),thus the neurotoxicity of excessive nitricoxide(NO) is abated.
Key words：Neurotrophin3(NT3);       Spinal Cord Injury;       Nitricoxidesynthase(NOS)
           
　　神经营养因子3(NT3)能促进脊髓损伤后运动功能的恢复，对神经元具有保护作用，但是其作用机制至今仍不清楚，本试验在大鼠脊髓损伤后局部给予NT3观察其对NOS水平的影响，探讨NT3的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1．1　材料与仪器

　　NOS测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)752型分光光度计(上海第三分析仪器厂)，37℃恒温水浴箱，NT3(CYTOLAB公司)SD大鼠(第三军医大学大坪实验动物中心)

　　1．2 动物与分组

　　健康成年SD大鼠105只，体重220～270g，雌雄不拘，分为3组：(1)NT3组(实验组)35只，在术后即刻、4、8、12、24h、3、7d经蛛网膜下腔给予NT3溶液20μl(含NT3 200ng；(2)生理盐水组(对照组)35只，在相同时点注入等容积生理盐水；(3)假手术组35只只打开椎板，蛛网膜下腔置管，不造成损伤。

　　1．3 动物模型

　　20％乌拉坦(1000mg／kg)腹腔麻醉，以T8为中心，取背部正中切口，长约5cm，依次切开皮肤，皮下组织，显露棘突，锐性切开椎旁肌并以刀柄向两侧分离，显露T7～12棘突及椎板，用文氏钳小心咬除T7～10棘突，咬除T8全椎板，以脊髓为中心显露直径约3mm圆形区。再咬除T10右侧半椎板，暴露硬脊膜，作为蛛网膜下腔置管区。用薄铜片约3mm×3mm弯成弧形与脊髓表面形状一致，以6g×5cm致伤力造成大鼠T8脊髓损伤模型。大鼠尾巴痉挛性摆动，双下肢及躯体回缩扑动后双下肢瘫痪，为造模成功标志。造模成功后，用显微镊轻提T10处硬膜，偏离后正中血管在硬脊膜上用针头(1ml注射器)制孔，见脑脊液流出后慢慢向脊髓损伤方向于蛛网膜下腔插入细导管(内径约0．1mm)约3mm，并于椎旁软组织及皮肤固定，手术组和对照组分别在术后即刻、4、8、12、24h、3、7d给予NT3溶液20μl(含NT3 200ng)或等容积生理盐水，假手术组，只打开椎板不造成损伤，插入导管后固定缝合，不给予任何处理。

　　1．4 术后处理

　　对24h、3、7、14d时点大鼠进行BBB功能评分，各组于术后4、8、12h和24h、3、7、14d分别取5只大鼠自右心取血，用南京建成生物工程研究所NOS测定试剂盒，比色法测定NOS吸光度，其原理为NOS催化LArg和分子氧反应生成NO，NO与亲核性物质生成有色化合物，在530nm波长下测定吸光度，根据吸光度的大小NOS活力。取血后进行生理盐水和4％多聚甲醛液灌注，切取损伤区脊髓组织，4％多聚甲醛溶液固定，脱水，石蜡包埋，切片，尼氏染色，观察神经元及尼氏体变化。

　　1．5 统计学处理

　　所有数据用SPSS10．0软件包处理，以均数±标准差(±s)表示，组间差异采用独立样本t检验。P<0．05，为差异有显著性,P<0．01为差异非常显著。

　　2 结果

　　2．1 血中NOS活性变化

　　NOS活性检测(表1)显示除术后4h对照组与试验组无显著差异以外，其余时点二者均有显著差异，12h　NOS水平达高峰，对照组NOS水平及升幅均显著高于实验组；7d后实验组与假手术无明显差异，但与对照组仍有显著性差异，表明NT3能显著抑制NOS水平并对神经功能起到保护作用。表1 大鼠脊髓损伤后血中一氧化验氮合成酶活性变化(略)

　　2．2 组织学染色

　　对照组伤后4h出现明显出血灶,8h出现脊髓灰质结构破坏，大量神经元死亡，前角部分神经元尚存，但Nissl体减少，其中部分神经元固缩，伤后24h损伤段灰质中神经元数量明显减少，细胞呈现空泡状核，核仁着色明显，核质不着色，胞浆内有少量深紫色的呈块状或点状的Nissl体(图1)。实验组出血量明显减少，前角细胞残存数量较多，染色深(图2)，假手术神经元形态及数量，Nissl体数量变化均不大(图3)。

　　2．3  功能评分(表2)表2大鼠脊髓损伤BBB评分变化(略)

　　对24h、3、7、14d时间点的大鼠进行BBB评分结果显示实验组与对照组在运动功能恢复上有显著差异，实验组明显优于对照组，尽管在术后14d实验组与假手术组仍存在显著性差异，但仍表明NT3能明显促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复。

　　3 讨论

　　脊髓损伤包括原发性和继发性损伤。原发性损伤是损伤后的即刻反应，继发性损伤是其后的病理反应扩大和泛化的过程，在对不可逆的原发性损伤尚无有效的方法的情况下，目前脊髓损伤后治疗的主要目的在于阻止或减少继发性损伤的发生，最大限度地保存受伤脊髓的功能。许多因素如兴奋性氨基酸、单胺、神经肽、血小板活化因子、自由基、脂质过氧化、Ca2+等均参与了继发性损伤过程。近年来一氧化氮(NO)作为体内的生物活性分子已被证实参与了脊髓损伤后的多种化学反应过程，过量的NO可以增加神经元死亡的数目并且与脊髓水肿密切相关。原因可能是SCI后NO通过氧化作用使脂质过氧化，造成膜结构的破坏导致细胞膜及血脊屏障的损伤，加剧水肿的发生［1］。同时过量NO生成又可介导兴奋性氨基酸神经毒性，与超氧阴离子反应形成毒性很强的过氧化硝基阴离子和羟自由基引起广泛的脂质过氧化及蛋白质酪氨酸硝基化反应，与细胞内许多酶的铁硫中心结合，破坏线粒体传递体系和柠檬酸循环，抑制靶细胞氧化呼吸，干扰DNA双链，影响其转录翻译等，促使细胞死亡，产生组织损害［2］。有研究表明NO能抑制脊髓及背根神经节细胞的体外存活和突起生长，对脊髓修复不利［3］。NOS是NO生物合成的关键酶，其在体内的水平直接决定NO的含量。在中枢神经系统有3种NOS同工酶：神经元型NOS(nNOS)、诱导型NOS(iNOS)和内皮型NOS(eNOS)，均能产生NO。nNOS和eNOS为钙依赖性，合称为固有型一氧化氮合酶(cNOS)。刘成龙等［4］研究认为大鼠脊髓损伤后6h nNOS达高峰，24h iNOS达高峰，赵立等［5］研究发现cNOS在伤后10min活性升高，30min达高峰。本实验结果显示伤后12h总NOS达高峰，可能原因为伤后12h nNOS略有下降而iNOS处于上升阶段，两者叠加后显示总NOS水平达到高峰。既往研究多取脊髓匀浆测定NOS，这在临床应用中受到一定的限制。本实验用测定血清中NOS吸光度出NOS水平，为今后的临床应用提供了方便。

　　神经营养素3具有广泛的生作用，能促进神经元的生长、发育、分化和成熟，对神经系统发育及维持其正常生理功能有重要意义，可阻止胚胎期及出生后运动神经元细胞死亡，维持神经元的存活及促进神经损伤后的修复与再生，并参与调节神经元突触活动。在发育中及成熟后的大鼠中，NT3能促进脊髓损伤后皮质脊髓束的生长，且能阻止大鼠发育中损伤红核神经元的退行性死亡，体外研究表明NT3能微弱而短暂地刺激成熟的少突胶质细胞增殖并分化成为髓鞘形成细胞［6］。

　　本实验研究表明NT3能显著抑制NOS的表达，减少脊髓前角运动神经元的丢失，促进运动功能的恢复，随着NOS水平的下降，脊髓前角运动神经元丢失减轻，BBB评分分值上升，三者之间体现了一致性，表明通过抑制NOS的表达，减少NO的生成可能是NT3发挥作用的机制之一。NT3促进脊髓损伤后运动功能恢复是否有其它机制尚有待进一步研究。
   
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　　［1］邵擎东，肖建如，包聚良，等．脊髓损伤后一氧化氮含量及一氧化氮合酶活性的变化与脊髓水肿的关系［J］．矫形外科杂志，2000，7(10)：989-990．

　　［2］Zhang J，Dawon VL，Dawon TM，et al．Nitricoxide activation of poly(ADP ribose)synthetase in neurotoxicity［J］．Science,1994,263：687-689．

　　［3］廖柏松，杨浩，鞠躬．一氧化氮对体外培养脊髓及背根神经节细胞的作用［J］.第四军医大学学报,1996，17(6)401-403．

　　［4］刘成龙，靳安民，周初松，等．大鼠脊髓损伤后一氧化氮合酶基因表达的变化［J］．中华实验外科杂志，2001，18(1)：74-75．

　　［5］赵立，李涛，贾连顺．脊髓损伤后一氧化氮合酶活性变化的动态观察及其基因表达［J］．中国矫形外科杂志，2000，7(12)：1196-1198．

　　［6］Yan H，Wood PM．NT-3 weakly stimulates proliferation of adult rat O1(-)O4(+)oligodendrocytelineage cells and increases oligodendrocyte myelination in vitro［J］．J Neurosci Res,2000,62(3)：329-335．