天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞凋亡及bax、bcl?2基因表达的影响

            作者：黄益玲，黄利鸣，胡火军，黎家华, 张兆祥

【摘要】  目的研究天花粉蛋白对人宫颈癌HeLa细胞的诱导凋亡作用并探讨其对凋亡相关基因bax和bcl?2表达的影响。方法不同浓度天花粉蛋白分别处理HeLa细胞24~72h后， MTT法检测细胞的生长活性, 显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞周期, Western Blot检测凋亡相关蛋白bax，bcl?2的表达。结果显微镜下观察到细胞圆缩，染色体凝聚等凋亡细胞的形态学改变，流式细胞仪直方图上亦出现特征性的亚二倍体峰， 随着天花粉蛋白浓度的增加，bax基因的表达增加而bcl?2的表达减少。结论天花粉蛋白对HeLa细胞的生长具有抑制作用，可诱导宫颈癌HeLa细胞发生凋亡，bcl?2蛋白的减少与bax蛋白表达增多可能是HeLa细胞凋亡的机制之一。

【关键词】  天花粉蛋白；HeLa细胞；细胞凋亡

    1材料和方法 

    1.1材料

    1.1.1主要试剂MEM培养基和胎牛血清（FBS）购自美国GIBCOBRL公司，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）为Simga公司产品，蛋白酶K（Proteinase K）为Merck 公司产品，噻唑蓝(MTT)购自Amresco公司。一抗bcl?2、bax鼠抗人单克隆抗体、β?actin羊抗鼠单克隆抗体、二抗HRP标记的羊抗鼠IgG及兔抗羊IgG购于Santa Cruz Biotechnology公司，TCS购自上海金山制药厂。

    1.1.2主要仪器及设备凝胶成像仪Thermal imaging system FTI?500为Pharmacia Biotech产品， 电转移槽为BioRad公司产品，STORM (Phospher Imager System)购自Dynamic molecular公司。

    1.2方法

    1.2.1细胞培养人宫颈癌HeLa细胞为本室传代保存，培养于5%  ＣＯ2、37℃湿化孵箱中。培养基MEM含10% FBS，0.1Ｕ/Ｌ青霉素, 0.1Ｕ/Ｌ链霉素, 取对数生长期细胞待用。

    1.2.2MTT法测定TCS对HeLa细胞的生长抑制作用取对数生长期的HeLa细胞接种于96孔细胞培养板中(细胞数为每孔2×104个)，12h后加入不同浓度的TCS，每个浓度设6个平行孔，继续培养24、48、72h，每孔加入5μg/ml   MTT 溶液20μl继续培养4h后加入200μl   DMSO溶解，测定570nm处光吸收值，细胞生长抑制率。

    1.2.3细胞形态学观察将处于指数生长期的HeLa细胞以不同浓度的TCS处理后，倒置显微镜下观察HeLa细胞的形态改变。

    1.2.4流式细胞仪DNA含量分析离心收集经TCS作用的细胞，以含0.2%  FBS的PBS清洗后加入75%的冰冷乙醇固定, 在10000r/min条件下离心5min，去乙醇，以PBS洗涤2次，弃上清；用0.5ml  PBS重新悬浮，然后加入等体积的细胞裂解缓冲液(含1％  NP?40，50mmol/L Tris?HCl，40mmol/L  EDTA，pH值7.5)室温作用5min，离心后加入RNase(终浓度30μg/ml)置37℃水浴中消化30min，离心后再加人1ml   PI(终浓度50μg/ml)避光染色30min，以300目尼龙网滤过，上流式细胞仪检测，Multicycles软件分析结果。

    1.2.5Western Blot检测凋亡相关蛋白bax及bcl?2离心收获细胞，用预冷的PBS漂洗2遍，加入适量的细胞裂解液（临用前加入各种蛋白酶抑制剂）置冰上30min后，以13000r/min于4℃离心20min，调整蛋白含量, 加入等量2×SDS?PAGE加样缓冲液，置95℃~100℃沸水中变性5min，行SDS?PAGE垂直电泳, 电转PVDF膜，加50g/L脱脂奶粉于4℃冷库封闭过夜（或37℃封闭1h）， PBST洗膜后，分别加一抗bcl?2、bax鼠抗人单克隆抗体、β?actin羊抗鼠单克隆抗体(均为1∶1000稀释)37℃孵育1h，PBST洗膜；加HRP标记羊抗鼠IgG及兔抗羊IgG二抗，37℃孵育1h，PBST洗膜，等量的ECL反应液A和B混合后加至膜上1min，最后Χ片显影。

    1.2.6统计学分析数据以±s表示， 用t检验分析差异显著性， 采用Pearson相关分析进行相关检验，运用SPSS10.0统计软件分析数据。

    2结果

    2．1TCS对HeLa细胞的生长抑制作用对照组HeLa细胞体外生长活跃, 实验组分别经20、40、80μg/ml TCS处理24、48、72h后，细胞生长均不同程度地受到抑制，呈时间-浓度依赖性, 按公式相对抑制率。相对抑制率 (%)=(1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100%，结果有统计学差异（P<0.01），见表1。表1天花粉蛋白对HeLa细胞生长的相对抑制率（%）作用时间（％）TCS浓度20μg/ml40μg/ml80μg/ml24h14.12＊22.72＊51.53＊48h30.96＊41.62＊69.78＊72h41.99＊49.63＊78.95＊注：＊与对照组比较，P<0.012．2HeLa细胞的形态学改变对照组HeLa细胞为多角形或梭形， 贴壁牢固。 经TCS处理的实验组细胞逐渐变圆,   细胞体积缩小， 胞浆凝缩,  折光率增强,  细胞膜完整但出现发泡现象,   随着时间的延长悬浮细胞逐渐增多， 出现细胞凋亡的特征性改变。

    2．3流式细胞仪检测（PI染色法）凋亡细胞在流式细胞仪直方图上出现特征性的亚二倍体峰（sub?G1 peak），对照组细胞的凋亡率为(4.1±0.4)%，用不同药物浓度的TCS（20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml）处理HeLa细胞48h后，可出现明显的凋亡峰，凋亡率分别为（16.7±1.3)%、(47.5±1.1)%和(62.7±2.6)%，与对照组相比较有统计学差异(P<0.05)。表明随着TCS药物浓度的升高，凋亡细胞的比例增加，见图1（略）。

    2．4凋亡相关基因bax及bcl?2的表达随着TCS药物浓度的增加， bax的表达逐渐增加，而bcl?2的表达逐渐减少，见图2。1. untreated cells；2. TCS (20μg/ml);  

    3.TCS (40μg/ml);  4.TCS (80μg/ml)

    图2TCS作用48h后bax和bcl?2蛋白表达的变化3讨论  细胞凋亡是细胞在其生长、发育过程中发生的一种复杂的生理和病理过程，对机体的正常发育和自身稳定起着极其重要的作用。有研究表明：不少疾病(包括肿瘤)的发病与细胞凋亡受抑制有关，许多抗癌药物都是通过最终触发肿瘤细胞凋亡通路而达到的目的[2]。天花粉蛋白具有RNA N?糖苷酶活性，是一种很有前途的抗肿瘤药物,实验研究发现天花粉蛋白在体外对胃癌、肝癌、白血病等有不同程度的抑制作用[3?5]。本实验通过MTT法发现天花粉蛋白对HeLa细胞生长有明显的浓度依赖性抑制作用, 显微镜下观察到细胞圆缩，染色体凝聚等凋亡细胞的形态学改变，流式细胞仪直方图上亦出现特征性的亚二倍体峰，表明TCS对HeLa细胞具有明显的促凋亡作用。细胞凋亡受细胞内一系列基因的式精细调控, 在细胞凋亡的调控因素中, bcl?2家族基因倍受瞩目, 其中bcl?2基因是原癌基因，其突出作用是抑制细胞凋亡，bcl?2蛋白广泛存在于细胞的线粒体膜、细胞膜内表面、内质网、核膜等处。而bax是bcl?2的同源基因，它的过表达可拮抗bcl?2的保护效应使细胞趋于凋亡[6?7]。bax一方面能和bcl?2形成异源二聚体抑制凋亡, 另一方面其自身还能形成同源二聚体诱导凋亡。有研究表明[8]，与bax分离的bcl?2失去了抗凋亡能力，说明bcl?2与bax的结合是bcl?2发挥作用的前提。而当bax在细胞内超表达，并形成同源二聚体时,细胞对死亡信号的反应增强。所以bcl?2与bax的比例，是决定细胞接受致病信号刺激后成活与否的关键因素。比例增高细胞不易发生凋亡, 而比例降低则导致细胞凋亡。本实验经Western Blot检测后发现，TCS作用于HeLa细胞后, bax蛋白表达随着药物浓度的增加而增加，而bcl?2基因正好相反，其表达随着药物浓度的增加而减少, 两者的比值（bax/bcl?2）与凋亡率呈现一定的正相关性, 表明TCS诱导HeLa细胞凋亡与抑制bcl?2基因表达并且激活bax基因表达有关, 其具体机制尚待进一步研究。

【】
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