选择性EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼对宫颈癌离体细胞的放射增敏作用

                作者：刘俊丽， 陈元，蔡煜， 张敏

【摘要】  目的探讨表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼对宫颈癌离体细胞的放射增敏作用。方法以宫颈鳞癌Siha细胞，腺癌HeLa细胞为研究对象，利用MTT法检测吉非替尼对Siha和HeLa细胞的增殖抑制作用；利用集落形成实验检测吉非替尼对Siha、HeLa细胞的放射增敏效应。 结果吉非替尼能够抑制Siha、HeLa细胞的增殖，其IC20值分别是0.15μmol/L、0.32μmol/L，而且抑制作用呈剂量依赖性；吉非替尼作用于Siha、HeLa细胞72h后，放射增敏比SER分别为1.693、1.228。结论吉非替尼对宫颈癌Siha、HeLa细胞具有明显的放射增敏作用。

【关键词】  表皮生长因子受体；吉非替尼；宫颈癌；放射增敏

    1材料与方法

    1.1药物及试剂吉非替尼(Gefitinib,商品名IRESSA) 由AstraZeneca公司(Macclesfield, United Kingdom)提供，RPMI?1640购自Gibco公司，胎牛血清购自浙江民海公司。

    1.2细胞及培养宫颈鳞癌Siha细胞，腺癌HeLa细胞为同济肿瘤科实验室冻存。细胞在标准状态下(5％  CO2、 37℃)单层贴壁培养于含10％胎牛血清，1％双抗RPMI?1640培养基中。

    1.3甲基偶氮唑蓝(MTT)实验取对数生长期细胞制成1.5×104/ml细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200μl(即3×103个细胞/孔)。置于培养箱中培养。待细胞贴壁2h后吸弃旧培养液，加入各受试物继续培养24h；然后每孔加MTT液20μl(5mg/μl)，继续孵育4h，吸弃每孔培养液，加入150μl   DMSO, 用酶联仪以波长570nm测定各孔A值。实验设药物处理组、细胞对照组和空白对照组，每组均设3个复孔。药物处理组在铺孔10h后加入含不同浓度药物的20μl培养液；细胞对照组加入20μl培养液；空白对照组在铺孔时不加细胞悬液，只加200μl培养液。药物处理组加入吉非替尼的终浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10、50、100μmol/L，按下列公式求出增殖抑制率。选吉非替尼对细胞抑制率为20％的浓度（IC20）作为工作浓度，实验重复3次，取3次的平均值作为最终结果。按下列公式肿瘤细胞增殖抑制率:

    肿瘤细胞增殖抑制率=1－药物处理组A值-空白对照组A值细胞对照组A值?空白对照组A值×100%

    1.4集落形成法观察吉非替尼对放射后细胞存活率的影响取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化，计数活细胞数并逐级稀释后,将细胞分为对照组、单纯照射组、吉非替尼（IC20）+照射组、单纯吉非替尼组(IC20)接种于6cm平皿中, 每组均设3个重复平皿，培养12h后细胞贴壁。室温下用剂量率2.5Gy/min  6MV X线照射, 照射剂量分别为0、1、2、3、4、6、8Gy。其中吉非替尼＋照射组照射后立即加入IC20浓度的吉非替尼作用72h。在标准状态下培养2周，细胞经甲醇固定15min, Giemsa染色15min并计数, 计数细胞数≥50个的集落作为存活克隆。其中实验均重复3次,实验数据以±s表示。放射加药组得到的细胞存活分数均用相应单纯给药组细胞存活分数校正，以消除吉非替尼内在细胞毒性作用对存活分数的影响。应用多靶单击模型SF=1-(1-e-D/Do) n拟合存活曲线, 并计算D0、Dq值，放射增敏比以SER表示。

    1.5统计分析所有计量资料的数据均以±s表示， 采用SPSS11.0统计软件包对数据进行处理， 组间比较采用单因素方差分析， P<0.05为差异有统计学意义。

    2结果

    2.1MTT实验吉非替尼抑制Siha、HeLa细胞增殖的IC20值分别是0.15μmol/L、0.32μmol/L。吉非替尼对Siha、HeLa细胞的增殖均有明显的抑制作用，并且这种作用呈剂量依赖性。

    2.2集落形成实验剂量?细胞存活率曲线见图1， 单击多靶模型主要参数见表1， 结果显示吉非替尼对Siha和HeLa细胞均有放射增敏作用， 吉非替尼处理后细胞平均致死剂量（D0）减低，存活曲线肩区（Dq值）变小。▲为单纯照射组，■为照射＋吉非替尼(IC20)组

　　3讨论

　　宫颈癌作为家妇女最常见的恶性肿瘤之一，放疗后局部复发而导致疗效欠佳的问题一直困扰广大临床医务工作者。近年来有研究发现，EGFR及其配体在宫颈癌组织中存在过度表达的现象，吉非替尼是一种选择性的EGFR酪氨酸激酶抑制剂，目前尚未见其与放疗联合应用宫颈癌的相关报道。我们的前期研究已经表明[4]，高剂量的吉非替尼(10μmol/L)对宫颈癌细胞的增殖有明显的抑制作用，本实验中试图探讨吉非替尼与放疗联合应用对宫颈癌离体Siha、HeLa细胞放射敏感性的影响。我们在放射线作用后将细胞培养在含吉非替尼的培养基中，72小时克隆形成实验发现，吉非替尼可明显增加放射线对Siha、HeLa细胞的抑制作用，其SER分别为1.693、1.228。Giocanti等[5]观察到，吉非替尼放射前(2小时)及放射过程中(48小时?放射?24小时)对HeLa细胞没有明显的放射增敏作用。Solomon等[6]将吉非替尼与放射联合作用于A431细胞发现，在放疗后给予吉非替尼其放射增敏效应显著而放疗前给药则相反。在我们的预实验中发现无论在放疗前还是放疗的过程中给予吉非替尼均无放射增敏作用,而在放疗后则有放射增敏作用，考虑是否由于吉非替尼的放射增敏作用受到作用时序的影响。细胞内在DNA修复机制是影响放射敏感性的一个重要方面。有研究发现[7]Rad51是另外一种EGFR?TKI。 Erlotinib (商品名Tarceva)可减低在DNA双链断裂后修复同源重组中起关键作用的基因Rad51的表达，抑制放射损伤的修复，提高放射敏感性。我们用经典的细胞存活曲线证实了吉非替尼对Siha、HeLa细胞的放射增敏作用。从细胞存活曲线的参数来看，吉非替尼＋照射组的Dq小于单纯照射组，说明吉非替尼降低细胞的亚致死性损伤修复，从而使细胞存活分数降低，其是否与Erlotinib有相同的作用机制值得进一步探讨。综上所述，吉非替尼对宫颈癌Siha、HeLa细胞具有放射增敏作用。目前，国内已批准吉非替尼上市用于晚期非小细胞肺癌的治疗，作为一种抗肿瘤新药，与化疗药相比其毒副作用较小，如与放疗联用能增强疗效则有广泛的临床应用前景。吉非替尼的放射增敏作用及可能机制的研究将为临床应用提供更为确切的理论依据。

【】
  ［1］Ethier SP, Lawrence TS. Epidermal growth factor receptor si?gnaling and response of cancer cells to ionizing radiation[J]. Natl Cancer Inst, 2001, 93 (12): 890?891.

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[3]Velu TJ. Structure, function and transforming potential of the epidermal growth factor receptor[J]. Mol Cell Endocrinol,1990, 70（3）:205?216.

[4]刘俊丽，陈元，蔡煜．表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂ZD1839对宫颈癌细胞的作用[J].肿瘤防治研究，2006，33(7):512?515.

[5]Giocanti N, Hennequin C, Rouillard D, et al. Additive interaction of gefitinib ('Iressa', ZD1839) and ionising radiation in human tumour cells in vitro[J]. Br J Cancer, 2004,91(12): 2026?2033.

[6]Solomon B, Hagekyriakou J, Trivett M, et al. EGFR blockage with ZD1839 (“Iressa”) potentiates the antitumor effects of single dose and multiple fractions of ionizing radiation in human A431 squamous cell carcinoma[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2003,55(3):713?723.

[7]Chinnaiyan P, Huang S, Vallabhaneni G, et al. Mechanisms of Enhanced Radiation Response following Epidermal Growth Factor Receptor Signaling Inhibition by Erlotinib (Tarceva)[J]. Cancer Res, 2005,65 (8): 3328?3335.