饮酒增加广西乙醛脱氢酶2基因变异基因型携带者发生肝癌的危险性

               作者：叶新平，彭涛，苏智雄，肖开银，尚丽明，黎乐群

【摘要】  目的 研究乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因多态性与饮酒因素交互作用在广西原发性肝癌发生中的作用。方法 对广西壮族自治区300例肝癌患者和292例正常对照人群进行流行病学调查研究，并用PCR?RFLP方法检测ALDH2基因型。结果 肝癌组和对照组中ALDH2变异基因型携带者分别占50.33%和47.95%（P=0.561）。肝癌人群ALDH2基因型不存在区域和民族差异（P>0.05）。饮酒频度每周≥3次的ALDH2*2携带者发生肝癌的危险性是饮酒频度每周<3次的ALDH2*1携带者的3.34倍(95%CI 1.75～6.41)。 HBsAg阳性者发生肝癌的危险性明显高于HbsAg 阴性者（P<0.001）。结论 ALDH2基因型不构成壮汉族间肝癌发病差异的基础，频繁饮酒可能是ALDH2基因变异基因型携带者发生肝癌的危险因素。

【关键词】  乙醛脱氢酶2(ALDH2)；基因多态性；饮酒；肝肿瘤；HBV

    乙醛脱氢酶2（ALDH2）是乙醛的主要代谢酶，ALDH2*1为野生型等位基因，在其12外显子发生G1510A点突变后，形成ALDH2*2。突变等位基因ALDH2*2对野生型ALDH2*1为显性，使ALDH2*2酶的活性显著降低，导致饮酒后乙醛在血中蓄积[1,2]，而乙醛被认为是乙醇的终致癌物，是引起乙醇相关癌的关键物质。本研究探讨肝癌高发区人群ALDH2基因多态性及环境因素与原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC) 易感性的关系。

    1 材料与方法

    1.1  对象 

    病例为2000年3月～2004年12月间，我院收治并经病理确诊的HCC300例，中位年龄为46.7±10.9岁，（男∶女＝265∶35）。对照为随机选取的广西地区无肝癌史的常住居民（无血缘关系），共计292例，中位年龄为47.0±10.4岁（男∶女＝261∶31）。

    1.2  材料 

    组织标本（病例组），病例组肝癌组织手术切除后保存于-80℃；血液标本（对照组），抽取5ml外周静脉血，EDTA?Na2抗凝，分离白细胞后-20℃保存，待提DNA。病例组和对照组分别抽取2ml外周静脉血分离血清后待测HBV五项。

    1.3  主要仪器及试剂 

    多通道PCR仪（美国MJ），凝胶电泳成像分析系统（美国Bio?Rad），Taq DNA 聚合酶、dNTPs、限制性内切酶Ksp632I均购自Ferments公司，引物购自上海生工公司。

    1.4  方法

    1.4.1  调查方法  采用统一的调查表，对每个研究对象进行问卷调查，内容包括一般情况、居住环境、饮酒习惯（饮酒种类、饮酒频率和持续时间）、吸烟习惯、饮食、状况、既往疾病及癌症家族史等。饮酒指每周饮高度白酒(乙醇含量>40%)至少1次，连续半年以上。

    1.4.2  HBV感染的检测  抽取静脉血，以800r/ min离心10min分离血清，用ELISA法测定血清中HBV五项标志(试剂盒购自华美生物工程公司)，以HBsAg阳性为HBV感染的指标。

    1.4.3  ALDH2基因型检测  采用饱和酚/氯仿法提取基因组DNA。ALDH2基因型确定：(1)RFLP?PCR引物序列[3]，F:5′CAAATTACAGGGTCAACTGCT 3′,R:5′CCACACTCACAG TTTTCTCTT 3′。PCR扩增体系为20μl，内含2μl 10×buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgCl2，引物各0.2μM，1U Taq酶及模板5μl（80～120ng）。扩增条件为：95℃×30s→54℃×40s→72℃×40s，35个循环。(2)取PCR产物10μl，10U限制性内切酶Ksp632I，2μl buffer，37℃水浴过夜。取5μl酶切产物加1μl上样缓冲液，3%琼脂糖电泳，电压5V/cm。(3)结果判断：纯合子野生型ALDH12（G/G）被消化成112bp和23bp两条片段；纯合子变异型ALDH22（A/A），不被酶切为153bp；杂合子ALDH2*1/2（G/A）消化后三条带，153bp、112bp和23bp,见图1。

    1.5  统计学分析

    M为Marker，其中1、3、4、5、7为纯合野生型（G/A），

    2、6为纯合变异型（A/A）；8、9为杂合型（G/A）

    图1  PCR?RFLP分析ALDH2基因型

    病例和对照组ALDH2基因型分布比较采用卡方检验，非条件Logistic回归模型相对风险度的比值比（Oddis Ratio，OR）及其95%可信区间（Confidential Interval，CI），P<0.05为有统计学意义，统计学分析采用SPSS11.5软件包进行。

    2 结果

    2.1  病例组和对照组均衡性检验结果

    病例组和对照组的性别、平均年龄、文化程度、职业、饮酒、吸烟及经济状况方面无显著性差异。病例组中一级亲属肿瘤家族史阳性者占12.00%，高于对照组7.53%（P=0.068）。

    2.2  HBV感染情况

    HCC组中HBsAg阳性率为84.67%（254/300），显著高于对照组（10.27%,30/292,P<0.001）。

    2.3  ALDH2等位基因频率在病例和对照组中的分布

    HCC和对照组中的ALDH12、ALDH1*22和ALDH22基因型频率分别为49.67%、40.37%、10.00%和52.05%、40.75%、7.20%，HCC组和对照组的ALDH2基因型频率均符合Hardy?Weinbery遗传平衡检验（χ2值分别为0.547和0.122，P值均大于0.05），说明样本具有群体代表性。按HCC病人所在区域，分为桂东（75人）、桂南（89人）和桂西（97人），桂北人数较少，不纳入统计范围。其ALDH2*2基因型频率分别为：57.33%、55.06%和40.30% (其三者之间P值均大于0.05)。

    2.4  汉、壮族人群ALDH2基因型频率在病例和对照组中的分布

    300例HCC中汉族245例，壮族52例，292例对照组中汉族193例，壮族88例。汉壮族人群ALDH2基因型频率在病例组和对照组中的分布见表1和表2，其差异无统计学意义（P>0.05）。

    2.5  ALDH2基因型与饮酒因素的交互作用

    饮酒人数在病例和对照组分别为：214和210（占71.33%和71.92%，P>0.05）。饮酒频度每周≥3次的ALDH2*2携带者发生HCC的危险性是饮酒频度每周<3次的ALDH2*1携带者的3.34倍，统计学分析病例组和对照组间差异有显著性,见表3。表1  汉族和壮族人群ALDH2基因型表2  汉族和壮族人群ALDH2基因型表3  不同饮酒频度人群ALDH2基因型注：多变量分析采用非条件Logistic回归调整HBV感染；*：P<0.001

　　3  讨论

    ALDH2基因多态性与肿瘤易感性关系的研究，目前主要集中在上消化道癌。由于基因型存在区域、种族的差异，报道不尽一致。日本学者Munaka等[4]对78例肝癌和138例健康人进行病例对照研究显示，肝癌组ALDH2*2基因型频率显著高于对照组（OR=9.77,95%CI 1.63～58.60）；且一生饮酒达6000,000ml，明显增加肝癌发病风险（OR=4.52，95%CI 2.39～8.55），表明饮酒习惯可能增加肝癌的发生风险。丁建华等[5,6]对江苏泰州HCC 1∶1的病例—对照研究结果表明，病例组和对照组ALDH2变异基因型频率分布无差别，携带ALDH2变异基因型且HBsAg阳性者或大量饮酒（每月饮酒量达3L以上）者，二者交互作用所致的肝癌危险性显著增加（OR值分别为15.38和3.50）。

    本研究表明，肝癌组与对照组间ALDH2变异基因型携带者分别为：50.33%和47.95%，均高于江苏人群的分布频率[5?7]，二者统计学差异无显著性；在肝癌组ALDH2*2基因型频率分布：桂东>桂南>桂西，其分布统计学无明显差异，说明广西肝癌患者的变异ALDH2基因型分布无区域差异。广西是一个多民族大省，其中汉族和壮族为广西两大民族，本数据显示，壮、汉族人群ALDH2基因型频率在对照组和病例组的分布均无差异（P>0.05），由此说明ALDH2基因型不存在壮、汉民族间差异，也不构成两民族间肝癌发病差异的基础。

    无论饮酒者携带何种ALDH2基因型，在病例和对照组间均无统计学意义（P>0.05）；但高频饮酒（每周≥3次）的ALDH2*2携带者发生肝癌的危险性是低频饮酒(每周<3次)的ALDH2*1携带者的3.34倍（P<0.001），说明频繁饮酒增加ALDH2*2发生肝癌的风险性，这与研究报道相符[6,8]，其机制可能是携带无活性ALDH2*2基因型者频繁饮酒时，使血中乙醛的浓度增加和蓄积，引起细胞的遗传毒性，进而诱发肝细胞对乙醛的敏感性，增加机体患肝癌的危险性。本次研究中病例组HBsAg阳性率（85.00%）显著高于对照组（6.85%），其差异有统计学意义（P<0.001），表明乙肝病毒是肝癌发生的重要因素之一。探讨ALDH2基因多态性与肝癌易感性的关系，将有助于肝癌病因机制的阐明和高危人群的筛选，对于广西肝癌的预防工作具有重要意义。

【】
  ［1］ Isse T,Oyama T,Matsuno K,et al.Paired acute inhalation test reveals that acetaldehyde toxicity is higher in aldehyde dehydrogenase 2 knockout mice than in wild?type mice[J].J Toxicol Sci,2005,30(4):329?337.

[2] Isse T,Matsuno K,Oyama T,et al.Aldehyde dehydrogenase 2 gene targeting mouse lacking enzyme activity shows high acetaldehyde level in blood,brain,and liver after ethanol gavages[J].Alcohol Clin Exp Res,2005,29(11):1959?1964.

[3] Nishida N,Tanaka M,Hayashi N,et al.Association of ALDH2 genotypes and alcohol consumption with periodontitis[J].J Dent Res,2004,83(2):161?165.

[4] Munaka M,Kohshi K,Kawamoto T,et al.Genetic polymorphism of tobacco and alcohol related metabolizing enzymes and risk of hepatocellular carcinoma[J].J Cancer Res Clin Oncol,2003,129(6):355?360.

[5] 丁建华,李苏平,吴建中,等.乙醛脱氢酶?2与饮酒和HBsAg致肝癌交互作用[J].公共卫生,2003,19(3):260?262.

[6] 丁建华,吴建中,高长明,等.乙醛脱氢酶2基因多态性和饮酒习惯与肝癌的易感性[J].肿瘤,2004,24(4):309?312.

[7] 吴建中,丁建华,高长明,等.江苏汉族人乙醛脱氢酶2基因型分布及其与饮酒习惯的关系[J].癌变·畸变·突变,2004,14(2):90?93.

[8] Kato S,Tajiri T,Matsukura N,et al.Genetic polymorphisms of aldehyde dehydrogenase 2,cytochrome p450 2E1 for liver cancer risk in HCV antibody? positive Japanese patients and the variations of CYP2E1 mRNA expression levels in the liver due to its polymorphism[J].Scand J Gastroenterol,2003,38 (8):886?893.