乙酰肝素酶与大肠癌浸润、转移和血管生成的相关性

【摘要】  目的 探讨乙酰肝素酶与大肠癌浸润、转移和血管生成之间的关系。方法 应用原位杂交方法检测乙酰肝素酶mRNA在95例大肠癌组织中的定位及表达。并用免疫组化方法对全部标本进行CD105染色，记数肿瘤微血管密度（microvessel density,MVD）,分析乙酰肝素酶mRNA表达与大肠癌浸润、转移和MVD之间的关系。结果 95例大肠癌组织中,乙酰肝素酶mRNA阳性表达49例（51.57％），MVD平均值为（72.1±20.6）；阴性表达46例（48.42％），MVD平均值为（41.3±12.4），差异有统计学意义(P<0.01)。乙酰肝素酶mRNA表达与大肠癌组织浸润深度、淋巴结转移 及MVD有关(P<0.05)。结论 乙酰肝素酶可促进大肠癌的浸润、转移和血管生成，可作为反映大肠癌生物学行为的客观指标。

【关键词】  乙酰肝素酶；大肠癌；血管生成；转移

    乙酰肝素酶是近年来发现的肿瘤的重要功能酶,是体内惟一能够降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparin sulfate proteoglycan,HSPG)的一种β?D?葡萄糖醛酸内切酶，可以在特定部位裂解HSPG，促进肿瘤的浸润、转移和微血管形成[1]。 自从人类乙酰肝素酶基因被分离以来,人们发现它与许多恶性肿瘤的浸润转移和微血管形成有关[2?4]。大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一,乙酰肝素酶mRNA表达是否与大肠癌的侵袭性生长、淋巴结转移和血管形成有关,国内尚未见报道。我们应用原位杂交方法，对95例大肠癌组织，进行乙酰肝素酶mRNA检测和肿瘤微血管免疫组化染色，计数肿瘤微血管密度（microvessel density ，MVD），探讨乙酰肝素酶与大肠癌浸润、转移和血管生成之间的关系。

    1  资料和方法

    1.1  标本来源  收集本校病教研室及开封市第一人民病理科2000～2004年大肠癌手术切除标本共95例，其中男58例，女37例，年龄25～70岁 ，平均（56±10.8）岁。所有病例术前未经任何化疗和放疗。肿瘤组织学分级分型均根据全国大肠癌病理研究统一规范，高分化癌15例，中分化癌45例，低分化癌35例；侵及至肌层者25例，侵及浆膜层及浆膜外者70例；Dukes分期属于A期10例，B期15例，C期62例，D期8例。大肠癌同时伴有淋巴结转移者63例，无淋巴结转移者32例。标本均经10%中性缓冲福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片。检测mRNA标本所用载玻片均经APES处理，0.1％DEPC水浸泡。所用标本均经病理学明确诊断。

    1.2  免疫组织化学染色  标本均经10%福尔马林固定，连续切片，分别作HE及免疫组化染色。CD105单克隆抗体由Santa Cruz生物技术公司生产。按常规SP 法进行，石蜡切片常规脱蜡至水后，微波抗原修复，0.3%H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶。DAB显色，苏木素复染、脱水、透明、封片、光镜下观察。每批染色均设阴性对照和阳性对照，阳性对照为已知阳性组织片，阴性对照用PBS代替一抗。

    1.3  肿瘤MVD记数  参照 Weidner 等[5]报道的方法，以与背景明显有别的任何一个棕色染色的内皮细胞或细胞丛作为一个血管，只要结构不相连续，分支结构也作为一个血管计数。先在100倍光镜下寻找肿瘤中血管密度最高的5个区域，然后在400倍镜下记数MVD，5个区域的均值为该肿瘤的MVD值。

    1.4  探针标记  采用Primer Premier 5.0软件设计反义寡核苷酸链，共35个bp  (5′＞CTTGCCTCATCACCACTTCTATTCCCATTCGGCTT＜3′)，由上海生物工程公司合成。取1pmol量，采用德国保灵曼公司加尾寡核苷酸探针标记试剂盒，标记出1μg加尾反义寡核苷酸探针。

    1.5  乙酰肝素酶mRNA原位杂交  ①组织切片预处理：切片66 ℃烤片过夜，至新鲜二甲苯中20min脱蜡，逐级0.1％DEPC稀释乙醇至水，0.2mo1/LHCl酸化，5m1/L蛋白酶K37℃消化20 min。0.01MPBS(pH7.4)冲洗3次。②杂交：在组织上滴加预杂交液，2×SSC湿盒内预杂交3h。每片组织滴加浓度为50ng/ml的乙酰肝素酶地高辛标记探针20μl，至2×SSC湿盒42℃杂交过夜。③洗涤、显色：杂交后分别用2×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC洗涤5min×3次，37℃封闭20min，滴加生物素化鼠抗地高辛抗体，37℃、60min，0.01MPBS洗涤3次，滴加SABC 37℃、20min，DAB显色20min终止，充分水洗。苏木精复染，脱水、透明、封片。同时以子宫平滑肌瘤为阴性组织对照标本，黑色素瘤转移淋巴结为阳性对照，以预杂交液代替探针作为空白对照。

    1.6  结果判断  原位杂交的阳性信号位于胞浆中，阳性信号为棕黄色，呈颗粒状。阳性细胞＜1％为阴性。

    1.7  统计学处理 采用SPSS10.0软件进行分析，对实验结果采用χ2检验和t检验。

    2  结果

    2.1  乙酰肝素酶mRNA在大肠癌中的表达

    用原位杂交法检测95例大肠癌组织。结果表明，乙酰肝素酶mRNA棕黄色颗粒阳性信号在癌细胞胞浆内。95例大肠癌组织中，阳性49例，阴性46例，阳性率为51.57％，见图1。

    2.2  乙酰肝素酶mRNA表达与大肠癌侵袭性生长的关系

    95例大肠癌标本中，乙酰肝素酶mRNA阳性49例，占51.57％。经病理证实癌细胞浸润浆膜层者70例，无浆膜层浸润者25例。在有浆膜层浸润者中，乙酰肝素酶mRNA阳性43例，占61.42％。无浆膜层浸润者中，乙酰肝素酶mRNA阳性6例，占24.00％，两组比较差异有统计学意义（χ2=10.33,P＜0.01）。

    2.3  乙酰肝素酶mRNA表达与大肠癌淋巴结转移的关系

    本组大肠癌患者中，经病理证实大肠癌伴有淋巴结转移者63例，无淋巴结转移者32例。在63例伴有淋巴结转移的大肠癌组织中，乙酰肝素酶mRNA 阳性表达40例 ，占63.49％。在32例无淋巴结转移的大肠癌组织中，乙酰肝素酶mRNA 阳性表达9例，占28.12％。在有淋巴结转移和无淋巴结转移之间，阳性表达率差异有统计学意义（χ2=10.62,P＜0.01）。

    2.4  乙酰肝素酶mRNA表达与MVD的关系

    用免疫组化方法对每例大肠癌切片进行CD105 染色，阳性部位位于血管内皮细胞，癌组织内见多量微血管呈棕褐色，深染，逗点状、小管状或条索状。95例大肠癌组织MVD平均值为(58.1±22.7)。乙酰肝素酶mRNA阳性表达49例，MVD平均值为(72.1±20.6)；阴性表达46例，MVD平均值为(41.3±12.4)，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

    3  讨论

    HSPG是一种蛋白聚糖类碳水化合物，广泛存在于各种组织细胞外基质（extracelluler matrices,ECM）和细胞表面的生物大分子,也是基底膜的主要构成成分。它能与细胞表面及ECM中的活性分子结合，黏附于细胞表面，是ECM聚集和稳定的基础[6]。肿瘤细胞浸润和转移包括两个方面：肿瘤细胞穿过细胞外基质（ECM）与血管基底膜（BM）组成的屏障和新生血管形成。在这个过程中，ECM中的各种成分和HSPG的降解必不可少，乙酰肝素酶作为体内唯一能够降解HSPG的糖苷酶,可以通过降解细胞外基质和血管基底膜，破坏基质正常结构，使肿瘤组织易于扩散和转移。

    通过采用地高辛标记的反义寡核苷酸探针，特异性地与组织中乙酰肝素酶mRNA杂交，结果显示在有浆膜层浸润的大肠癌组织中，乙酰肝素酶mRNA的表达明显高于无浆膜层浸润者；在大肠癌伴有淋巴结转移者中的表达较无转移原发灶组织中有显著增加。这表明乙酰肝素酶mRNA阳性表达与大肠癌的侵袭性生长和淋巴结转移有关。这一特征与报道相一致。Zhang等[7]对51例肝细胞癌乙酰肝素酶mRNA的表达水平进行检测后发现，乙酰肝素酶的表达水平与肿瘤的浸润程度有明显的正相关性。Ohkawa等[8]检测了75例食管鳞状细胞癌中乙酰肝素酶的分布，发现乙酰肝素酶的表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期等有关。抑制乙酰肝素酶的活性可以控制食管癌的浸润和转移。Kurokawa等[9]对人口腔黏膜上皮癌组织的研究发现乙酰肝素酶活性与人口腔黏膜上皮癌的浸润呈正相关。由此说明,乙酰肝素酶在肿瘤细胞浸润和转移过程中有重要作用。

    肿瘤新生血管形成和肿瘤组织不可抑制的生长除了自身因素外，还有赖于瘤组织血管生成。乙酰肝素酶对血管生长和演进的作用主要表现在三个方面：与血管生长因子有强的亲和力；可稳定bFGF和其他生长因子；FGF类因子与乙酰肝素结合存储在ECM。血管生成是一个包括毛细血管基底膜的降解、内皮细胞的迁移和增殖、修饰胞外胶原蛋白基质的酶合成以及小管腔形成等复杂过程。研究证明,乙酰肝素酶可以通过直接、间接两种方式促进肿瘤血管生成:①乙酰肝素酶可以直接作用于内皮细胞以生芽方式促进血管生成;②乙酰肝素酶对HSPG的降解还可以释放结合在HSPG上的bFGF等促血管生成因子,促进肿瘤微血管形成[11]。bFGF是目前认为极有活性的血管生成因子之一,它对内皮细胞有促分裂和趋化作用,刺激内皮细胞胶原酶和纤维蛋白酶,能降解基底膜,并诱导毛细血管内皮细胞向三维胶原基质中迁移,形成毛细血管腔状结构。同时,它与VEGF促血管形成有协同作用,而VEGF作为强烈的血管通透因子和内皮生长因子,可以刺激内皮细胞增殖,诱发组织因子、胶原酶产生,从而诱发新生血管形成。乙酰肝素酶一方面通过降解细胞外基质促进大肠癌的浸润和转移；另一方面通过刺激血管内皮细胞的增生促进肿瘤血管形成，为其生长提供物质基础[10]。通过研究发现，在大肠癌有浆膜层浸润和无浆膜层浸润；有淋巴结转移与无淋巴结转移的病例中，乙酰肝素酶mRNA的表达之间有显著性差异，表明乙酰肝素酶与肿瘤的生长、浸润和转移密切相关。它通过降解细胞外基质和促进新生血管的形成而促进大肠癌的生长、浸润和转移，乙酰肝素酶可成为反映大肠癌生物学行为的客观指标。

【】
  ［1］Boyd DD,Nakajima M.Involvement of heparanase in tumor metastases: a new target in cancer therapy[J].J Natl Cancer Inst,2004,96(16):1194?1195.

[2] Kurokawa H,Katsube K,Podyma KA,et al.Heparanase and tumor invasion patterns in human oral squamous cell carcinoma xenografts[J].Cancer Sci,2003,94(3):277?285.

[3] Ohkawa T,Naonoto Y,Nobuhisa T,et al.Heparanase expression at the invasion front of human head and neck cancers and correlation with poor prognosis[J].Clin Cancer Res,2005,11(8):2899?2906.

[4] Xiao Y,Kleeff J,Shi X,et al.Heparanase expression in hepatocellular carcinoma and the cirrhotic liver[J].Hepatol Res,2003,26(3):192?198.

[5] Weidner N,Folkman J,Pozza F,et al.Tumor angiogenesis : a new significant and independent prognostic indicator in earli?stage breast carcinoma[J].J Natl Cancer Inst,1992,84(24):1875?1887.

[6] Brustmann H,Naude S.Vascular endothelial growth factor expression in serous ovarian carcinoma: relationship with high mitotic activity and high FIGO stage[J].Gynecol Oncol,2002,84(1):47?52.

[7] Zhang YL,Fu ZR,Ding GS,et al.Expression of heparanase mRNA and its clinical significance in primary hepatocellular carcinoma[J].Zhonghua Zhong Liu Za Zhi,2003,25(4):359?361.

[8]Ohkawa T,Naonoto Y,Takaoka M,et al.Localization of heparanase in esophageal cancer cells: respective roles in prognosis and differentiation[J].Lab Invest,2004,84(10):1289?1304.

[9] Kurokawa H,Katsube K,Podyma KA,et al.Heparanase and tumor invasion patterns in human oral squamous cell carcinoma xenografts[J].Cancer Sci,2003,94(3):277?285.

[10]Chen JQ,Zhan WH,He YL,et al.Expression of heparanase gene,CD44v6,MMP?7 and nm23 protein and their relationship with the invasion and metastasis of gastric carcinomas[J].World J Gastroenterol,2004,10(6):776?782.